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Nov 17, 2023

Un examen exhaustivo revela genes de resistencia a aminoglucósidos no descubiertos previamente en patógenos humanos

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 812 (2023) Cite este artículo 151 Accesos 4 Detalles de Altmetric Metrics La resistencia a los antibióticos es una amenaza creciente para la salud humana, causada en parte por

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 812 (2023) Citar este artículo

151 Accesos

4 altmétrico

Detalles de métricas

La resistencia a los antibióticos es una amenaza creciente para la salud humana, causada en parte por patógenos que acumulan genes de resistencia a los antibióticos (ARG) a través de la transferencia horizontal de genes. Por lo general, los nuevos ARG no se reconocen hasta que se han difundido ampliamente, lo que limita nuestra capacidad para reducir su propagación. En este estudio, utilizamos el cribado computacional a gran escala de genomas bacterianos para identificar ARG móviles no descubiertos previamente en patógenos. De aproximadamente 1 millón de genomas, predecimos 1.071.815 genes que codifican 34.053 enzimas modificadoras de aminoglucósidos (AME) únicas. Estos se agrupan en 7.612 familias (<70% de identidad de aminoácidos), de las cuales 88 se describieron previamente. Cincuenta nuevas familias de AME están asociadas con elementos genéticos móviles y huéspedes patógenos. De estos, 24 de 28 AME probados experimentalmente confieren resistencia a los aminoglucósidos en Escherichia coli, y 17 proporcionan resistencia por encima de los puntos de corte clínicos. Este estudio amplía enormemente la gama de determinantes de resistencia a aminoglucósidos clínicamente relevantes y demuestra que los métodos computacionales permiten el descubrimiento temprano de ARG potencialmente emergentes.

La resistencia a los antibióticos sigue propagándose entre los patógenos, amenazando con disminuir irrevocablemente la utilidad de los antibióticos en el tratamiento y la prevención de infecciones bacterianas1. La resistencia surge comúnmente cuando los microorganismos adquieren genes móviles de resistencia a los antibióticos (ARG) a través de la transferencia horizontal de genes2. Este proceso generalmente se ve facilitado por elementos genéticos móviles (MGEs), como plásmidos conjugativos y secuencias de inserción, que pueden permitir que los ARG se diseminen rápidamente entre células bacterianas en comunidades bajo presiones de selección suficientes3,4. Los patógenos se vuelven constantemente más resistentes mediante la acumulación de nuevos ARG, a menudo más eficientes5,6. Sin embargo, la falta de conocimiento sobre los procesos evolutivos detrás de esta transferencia genética en curso dificulta la implementación de medidas preventivas efectivas.

Los aminoglucósidos constituyen una clase importante de antibióticos cuya resistencia clínica está aumentando7,8. Estos compuestos tienen una larga historia de uso clínico, principalmente como tratamiento para infecciones por bacterias Gram negativas (por ejemplo, Enterobacteriaceae), pero también como tratamiento de segunda línea contra patógenos Gram positivos específicos (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis multirresistente)9. 10. La resistencia a los aminoglucósidos se asocia con varios mecanismos, donde la inactivación del fármaco por enzimas modificadoras de aminoglucósidos (AME) es más común en entornos clínicos11,12. Entre los mecanismos de AME, los más abundantes son las aminoglucósido acetiltransferasas (AAC) y las aminoglucósido fosfotransferasas (APH)13,14. Los AAC actúan acetilando aminoglucósidos en la posición 1 (AAC(1)), 2' (AAC(2')), 3 (AAC(3)) o 6' (AAC(6')). La mayoría de estas enzimas pertenecen a la gran familia de proteínas N-acetiltransferasa (GNAT) relacionadas con GCN515,16, excepto la mayoría de las enzimas AAC(3)17 y, potencialmente, las enzimas AAC(1) para las cuales no se han hecho públicas secuencias13. Los APH, por otro lado, utilizan la fosforilación en la posición 2'' (APH(2'')), 4 (APH(4)), 3' (APH(3')), 3'' (APH(3') ')), 6 (APH(6)), 7'' (APH(7'')) o 9 (APH(9)) para inactivar los aminoglucósidos. Los orígenes de las APH no están claros, pero se ha planteado la hipótesis de que comparten una historia evolutiva con las fosfotransferasas macrólidas Mph y las proteínas quinasas eucariotas (por ejemplo, la proteína quinasa dependiente de AMPc) debido a su similitud estructural18,19. Entre los AME, los AAC tienen la mayor diversidad conocida, con 86 secuencias de genes presentes en ResFinder20, en comparación con las 39 secuencias de genes de APH reportadas hasta la fecha. Sin embargo, aún se desconoce la diversidad total de estas enzimas.

Se sabe que las comunidades bacterianas presentes en humanos, animales y ambientes externos mantienen una gran diversidad de ARG. Esto incluye genes que codifican AME y constituye un reservorio a partir del cual se pueden reclutar genes en patógenos21,22,23,24. Los orígenes recientes de la mayoría de los ARG aún se desconocen, lo que sugiere que probablemente se movilizaron a partir de especies que aún no están bien representadas en los repositorios de secuencias actuales25. En consecuencia, los nuevos ARG emergentes a menudo se identifican después de que se generalizan en los patógenos y, por lo tanto, constituyen un problema clínico sustancial. Por ejemplo, la beta-lactamasa NDM-1 se descubrió originalmente en una infección por Klebsiella pneumoniae adquirida en la India en 200826, pero ya en 2009, el gen se encontraba con frecuencia en clínicas de la India, Pakistán, Bangladesh y el Reino Unido27. Esta rápida aparición sugiere que NDM-1 era comúnmente transportado por patógenos antes de su descubrimiento. De manera similar, el determinante de resistencia a la colistina MCR-1 codificado por plásmido, que se observó por primera vez en aislados comensales y clínicos de China en 2015, estaba presente en al menos 16 países de dos continentes en el momento de su descubrimiento28,29. La incapacidad de detener los genes de resistencia emergentes conduce no sólo a un aumento de la morbilidad y la mortalidad de los pacientes, sino también a un aumento de los costes sanitarios30. De hecho, se ha estimado que los costos resultantes de un solo brote de bacterias portadoras de NDM en una sala de hospital son del orden de 1 millón de dólares estadounidenses31. Para proteger la eficacia de los antibióticos existentes y futuros, lo ideal sería identificar los ARG emergentes en una etapa temprana. Esto permitiría el diagnóstico de genes específicos y facilitaría la implementación de contramedidas, como el control y la vigilancia de infecciones específicas, para limitar una mayor diseminación.

Un desafío fundamental en la detección de ARG emergentes es su ausencia general en las bases de datos de secuencias, lo que dificulta su identificación mediante métodos estándar. Se pueden detectar nuevos ARG mediante metagenómica funcional32, pero esta técnica es costosa y tiene un rendimiento limitado y, por lo tanto, es difícil de implementar a gran escala. Alternativamente, se ha desarrollado una amplia gama de métodos computacionales para la predicción de ARG no caracterizados a partir de datos de secuenciación33. Estos métodos suelen aprovechar las bases de datos actuales de genes de resistencia, como ResFinder20 y CARD34, y utilizan modelos para predecir genes en función de su secuencia o características estructurales. Los ejemplos incluyen fARGene, que utiliza modelos de Markov ocultos (HMM) específicos de genes para identificar ARG homólogos con baja similitud de secuencia;35 deepARG, que aplica algoritmos de aprendizaje profundo para discriminar entre nuevos ARG y otros genes;36 y PCM37 y ARGGNN38, los cuales Utilice el aprendizaje automático para identificar nuevos ARG en función de las características de su estructura proteica. La validación experimental ha demostrado que la precisión general para la predicción computacional de ARG es >80%35, lo que convierte a estos métodos en una opción confiable para detectar nuevos genes de resistencia.

En este estudio, demostramos cómo se puede utilizar la predicción computacional para identificar genes de resistencia a aminoglucósidos no descubiertos previamente. Al analizar ~ 1 millón de genomas bacterianos, predijimos 1.071.815 genes que codifican 34.053 AME únicos, divididos en 7.612 familias de AME (<70% de identidad de aminoácidos). Entre ellas, 50 nuevas familias de AME contenían genes co-localizados con MGE y presentes en patógenos humanos. La validación experimental de genes de 28 de estas familias mostró que 24 inducían un fenotipo de resistencia en Escherichia coli, de los cuales 17 conferían resistencia por encima de los puntos de corte clínicos y/o valores de corte epidemiológicos (ECOFF). Nuestros resultados amplían enormemente el número de AME conocidos y proporcionan una visión única de los determinantes de resistencia a aminoglucósidos no caracterizados pero clínicamente relevantes. Concluimos que la detección computacional a gran escala de genomas bacterianos constituye una forma eficiente de identificar nuevos genes de resistencia antes de que se generalicen entre los patógenos.

Se predijeron nuevos genes que codifican AME en genomas bacterianos utilizando fARGene, un software que utiliza HMM optimizados para identificar ARG en datos de secuencia35. Se crearon nueve HMM (AI), que representan genes de dos mecanismos principales de AME: seis modelos (AF) para AAC y tres modelos (GI) para APH, según la filogenia (Figuras complementarias 1, 2, 3). La sensibilidad de los modelos se optimizó en función de secuencias de proteínas validadas experimentalmente únicas para cada modelo (Datos complementarios 1). Para garantizar una alta especificidad, los modelos también se optimizaron frente a conjuntos de datos negativos que consisten en genes con una relación evolutivamente cercana con AAC o APH que no se ha informado que confieren resistencia a los aminoglucósidos (Datos complementarios 1; consulte Métodos para obtener detalles completos). Después de la validación cruzada, los modelos mostraron una alta sensibilidad y especificidad; todos los modelos excepto uno mostraron una sensibilidad de 1,0 (0,9375 para el Modelo E [AAC(6')-I]), mientras que la especificidad de todos los modelos fue de 1,0 en el umbral optimizado. puntuación (Figura 4 complementaria, Tabla 1 complementaria).

A continuación, utilizamos los modelos optimizados y analizamos 990,306 genomas bacterianos descargados de NCBI Assembly39 en busca de genes que codifican AME. Esto produjo un total de 1.071.815 genes predichos, 153.317 de los cuales eran previamente desconocidos (Datos complementarios 2), que codifican 34.053 secuencias de proteínas únicas (después de agruparlas con una identidad de aminoácidos del 100%; Tabla 1) que representan AME nuevos y conocidos. Los AME previstos se agruparon en 7.613 familias de AME (<70% de identidad de aminoácidos), de las cuales 4.271 representaban AAC y 3.342 familias representaban APH. Entre los genomas analizados, 280.372 (28,3%) codificaron un solo AME, mientras que 261.295 (26,4%) codificaron múltiples variantes. Se predijeron hasta 997.373 AME (93%) en especies patógenas, pero como solo correspondían a 6.075 proteínas únicas (17,8%) en 204 familias de AME (2,7%), simplemente representaban una fracción de la diversidad genética predicha en todas las especies. Sin embargo, considerando que solo 112 (0,6%) de las especies portadoras de AME se clasificaron como patógenas, la cantidad de nuevos AME predichos en especies patógenas fue considerable (Fig. 1a). Esto fue especialmente cierto para los genes predichos por el modelo C [AAC(3)-II, III, VI, VII, VIII, IX], E [AAC(6')-I] y I [APH(6)-I + APH(3')-II], donde el 75%, 81% y 89% de las familias de AME previstas asociadas a patógenos eran nuevas, respectivamente. Sin embargo, en comparación con las especies no patógenas, los patógenos generalmente portaban una proporción menor de nuevos AME (Fig. 1b).

a Familias AME transportadas por patógenos. b Familias AME portadas por todas las especies. c Familias móviles de AME transportadas por patógenos. d Familias AME móviles portadas por todas las especies.

Se utilizó el análisis filogenético de los AME predichos por cada modelo para analizar su historia evolutiva. Se observaron claras desviaciones entre las filogenias del gen y del huésped para todos los modelos, lo que indica múltiples eventos de transferencia horizontal de genes (Figura complementaria 5). Para investigar más a fondo la movilidad potencial de los nuevos AME encontrados en patógenos, analizamos su contexto genético en busca de MGE. Identificamos 104 familias de AME asociadas a patógenos, de las cuales 50 (48%) no estaban presentes en los repositorios de ARG actuales, cuyos miembros se co-localizaron con elementos conjugativos, secuencias de inserción, integrones y/u otros ARG móviles conocidos (Figs. 1c y 2). La mayoría de las nuevas familias de AME asociadas a patógenos móviles (36) se encontraron en patógenos proteobacterianos (siendo Pseudomonas aeruginosa el más común). Sin embargo, entre los portadores también estaban presentes especies patógenas de Firmicutes (p. ej., Streptococcus sp.) y Bacteroidetes (Elizabethkingia anophelis). En particular, varias familias AME (p. ej., C24, H510, ver Datos complementarios 3) incluyeron genes presentes en múltiples filos, lo que sugiere que estos genes en algún momento se han sometido a una transferencia genética horizontal entre filos.

Las barras en la parte inferior indican la distribución de genes predicha por cada uno de los nueve modelos dentro de cada categoría. a Familias que representan nuevos AME y b Familias que representan AME conocidos.

Las nuevas familias de AME asociadas a patógenos móviles generalmente se asociaron con tipos específicos de MGE, y solo 10 familias (20%) se ubicaron conjuntamente con elementos de múltiples categorías. La indicación más común de MGE fueron genes involucrados en la conjugación, como relaxasas y/o genes de formación de pares de apareamiento, que se co-localizaron con AME de 34 nuevas familias asociadas a patógenos (68%; Fig. 2a). Se trataba principalmente de genes de formación de pares de apareamiento de las clases F, G o FATA y de la relaxasa MOBP1, que están asociados con una amplia gama de huéspedes40. Por el contrario, los AME asociados a patógenos conocidos se asociaron con una variedad más amplia de MGE, con 19 familias de AME (32%) co-localizando con elementos de todas las categorías incluidas. Se indicó que la conjugación también es el mecanismo principal por el cual se transfieren los AME conocidos, ya que los genes de 42 familias asociadas a patógenos conocidos (78%) aparecieron cerca de los genes de conjugación (Fig. 2b). Además, los genes de 27 de las nuevas familias de AME asociadas a patógenos (54%) se co-localizaron con otros genes de resistencia móvil, lo que sugiere que la co-selección puede desempeñar un papel en su diseminación. Estos ARG colocalizados incluían genes que confieren resistencia a betalactámicos, tetraciclinas, macrólidos, quinolonas y sulfonamidas, así como otros genes de resistencia a aminoglucósidos (Datos complementarios 3).

A continuación, analizamos el entorno de origen, la ubicación geográfica y la fecha de recolección de los aislados que contienen los nuevos AME asociados a patógenos móviles. A partir de esto, encontramos que 21 familias (42%) contenían al menos un gen identificado en un aislado clínico (Fig. 3a), y que se encontraron huéspedes de las nuevas familias de AME asociadas a patógenos móviles en todo el mundo (Fig. 3b). Curiosamente, se encontraron genes de siete familias en genomas aislados antes de 1979, lo que sugiere que han estado presentes en patógenos durante mucho tiempo (Fig. 3c).

Los paneles muestran el número de familias AME divididas según el aislamiento de sus anfitriones: un entorno (datos disponibles para 14.747 aislamientos (16%) que representan 39 familias AME (78%)), b continente (datos disponibles para 10.631 aislamientos (12%) que representan 41 familias AME (82%)), y c fecha de recolección (datos disponibles para 10,260 aislados (11%) que representan 41 familias AME (82%)). Tenga en cuenta que una familia puede contener variantes genéticas transportadas por múltiples huéspedes de diferentes fuentes.

Evaluamos la funcionalidad de los AME predichos mediante la expresión de genes representativos de 28 nuevas familias de AME asociadas a patógenos móviles en E. coli. Los fenotipos resultantes se evaluaron mediante pruebas de difusión en disco con siete aminoglucósidos diferentes. Los genes se seleccionaron para su evaluación en función de su riesgo potencial para la salud humana a través de la combinación de patogenicidad de la especie huésped, genes asociados a MGE co-localizados y otros ARG (Datos complementarios 3), así como la probabilidad de producir un fenotipo de resistencia medible en condiciones las condiciones probadas (asumiendo un fenotipo similar al homólogo conocido más cercano). De los 28 ARG probados, 24 (86%) confirieron una resistencia significativamente mayor (es decir, una menor susceptibilidad en comparación con el control con un valor de p <0,01; los valores de p exactos para cada prueba se muestran en los Datos complementarios 4) a al menos un aminoglucósido. mientras que 23 (82%) confirieron resistencia a múltiples aminoglucósidos en E. coli (Fig. 4). Si bien varios de los genes analizados proporcionaron una resistencia significativamente mayor a la amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina y tobramicina (12, 3, 22, 6, 12 y 11 genes, respectivamente), ninguno indujo resistencia a la espectinomicina. Al comparar los diámetros de las zonas de inhibición con los puntos de corte clínicos de EUCAST y ECOFF41, 17 de los genes analizados (61%) confirieron niveles de resistencia por encima de los puntos de corte para amikacina (D292, E111, E141, E449, E553, F309), gentamicina (C322, C1264) , neomicina (H957), netilmicina (D292, E64, E111, E141, E449, E526, E550, E553, E606, E657, E963, F72, F309, F314) y/o tobramicina (C322, C1264, E449, E553, E963). ) (Fig. 4, Fig. 6 complementaria).

Los paneles a-g muestran la diferencia media del diámetro de la zona de inhibición [mm] entre clones portadores de nuevos AME (n = 3 para cada gen y antibiótico) y controles susceptibles (n = 6 para cada antibiótico) para siete aminoglucósidos diferentes: amikacina (AK 30 µg ), gentamicina (CN 30 µg), kanamicina (K 30 µg), neomicina (N 30 µg), netilmicina (NET 10 µg), espectinomicina (SH 25 µg) y tobramicina (TOB 30 µg). Los puntos de datos individuales se presentan en la figura complementaria 6. Un aumento significativo del crecimiento (valor de p <0,01, prueba t unilateral de dos muestras) se indica mediante un asterisco encima de la barra, y los asteriscos rojos indican un nivel de resistencia más allá del clínico. punto de ruptura (amikacina, gentamicina, tobramicina) o ECOFF (neomicina). Las desviaciones estándar se muestran como barras de error. El panel h muestra una descripción general de los genes de resistencia a los antibióticos probados y los aminoglucósidos a los que cada gen confirió una resistencia significativamente mayor, con asteriscos que indican niveles clínicos de resistencia.

En este estudio, analizamos aproximadamente 1 millón de genomas bacterianos e identificamos genes que codifican enzimas modificadoras de aminoglucósidos (AME) de 7.613 familias de genes (<70% de identidad de aminoácidos). Esto incluyó 50 familias de AME no descubiertas previamente que se ubicaban conjuntamente con genes asociados con elementos genéticos móviles (MGEs) en patógenos humanos. Se identificaron genes de 21 de estas 50 nuevas familias de AME móviles asociadas a patógenos en aislados clínicos, lo que demuestra que ya están circulando entre los patógenos del microbioma humano. Los fenotipos de los AME predichos se confirmaron experimentalmente, y 24 de los 28 genes probados (86%) aumentaron significativamente la resistencia a al menos un aminoglucósido. Nuestros hallazgos amplían ampliamente el número de AME clínicamente relevantes conocidos y demuestran que el cribado computacional se puede utilizar para identificar posibles genes de resistencia emergentes.

Diecisiete (61%) de los AME validados experimentalmente confirieron resistencia por encima de los puntos de corte clínicos y/o ECOFF para amikacina, gentamicina, neomicina, netilmicina y/o tobramicina según lo definido por EUCAST (Fig. 4, Fig. Suplementaria 6). Sin embargo, es importante señalar que la extrapolación de los niveles exactos de resistencia generados en sistemas de expresión heterólogos siempre debe hacerse con precaución. Además, nuestro ensayo no se ajustaba exactamente a los estándares EUCAST ya que las validaciones utilizaron discos que contenían 30 µg de antibióticos (excepto netilmicina y espectinomicina, que utilizaron discos que contenían 10 µg y 25 µg respectivamente), mientras que los límites de EUCAST para gentamicina, neomicina, y tobramicina se basan en discos con cargas de 10 µg41 y, en este sentido, las estimaciones de resistencia que presentamos probablemente sean conservadoras. Por otro lado, utilizamos un vector de alta expresión, lo que probablemente resultó en niveles de resistencia más altos que los que se observarían de forma natural. Sin embargo, nuestros resultados muestran que varios de los AME identificados constituyen contribuyentes potenciales a la disminución de la eficacia de los aminoglucósidos y podrían, cuando están presentes en patógenos y se expresan en niveles suficientes, prevenir un tratamiento antibiótico exitoso. Cabe señalar que cuatro de los nuevos AME probados no proporcionaron resistencia a aminoglucósidos en nuestras condiciones experimentales (C24, C118, C715, E18), incluso después de que los genes se optimizaron con codones para E. coli. Sin embargo, es posible que estos genes sigan siendo funcionales en otros huéspedes o contextos genéticos. Curiosamente, estos cuatro AME estaban codificados por genes identificados originalmente en Streptococcus sp., lo que indica que pueden ser genéticamente incompatibles con E. coli. Sin embargo, dos de los otros AME probados que estaban asociados con Streptococcus (E449, E526) indujeron un fenotipo de resistencia, lo que demuestra que al menos algunos AME pueden funcionar en huéspedes evolutivamente distantes.

Nuestros resultados sugieren que los nuevos AME asociados a patógenos se transmiten principalmente mediante conjugación. Según criterios estrictos (ver Métodos), hasta el 68% de los 50 nuevos AME móviles asociados a patógenos se co-localizaron con genes implicados en la conjugación. Esto estuvo cerca de lo observado para los AME conocidos, de los cuales el 78% se encontraron en plásmidos conjugativos. Observamos que varios de los nuevos AME estaban asociados con plásmidos de huésped amplio, incluidos los plásmidos que portan sistemas de secreción de tipo IV de clase F y T, lo que sugiere un potencial para extenderse a grandes distancias evolutivas42. También hubo diferencias en el contexto genético entre AME nuevos y conocidos. Lo más sorprendente fue la asociación entre los AME y los integrones, donde solo el 6%, en comparación con el 48% de los AME nuevos y conocidos asociados a patógenos, respectivamente, se ubicaron cerca de las integrasas de clase 1. Los nuevos AME también estaban co-localizados en menor medida con ARG móviles conocidos. De hecho, el 91% de los AME asociados a patógenos conocidos estaban co-localizados con genes conocidos que confieren resistencia a otros antibióticos, incluidos betalactámicos, tetraciclinas y macrólidos, lo que solo fue cierto para el 54% de los nuevos AME. Esto podría indicar que varios de los nuevos AME encontrados en patógenos representan ARG emergentes que aún no se han asociado con los MGE más eficientes y/o co-localizados con otros ARG más establecidos y bien extendidos. Los plásmidos de resistencia a múltiples fármacos que portan grandes conjuntos de genes se forman mediante un proceso gradual que incluye varios eventos evolutivos consecutivos distribuidos en el tiempo43. También se ha observado una menor tendencia a la colocalización con otros ARG para las carbapenemasas, de las cuales se cree que muchas han sido transferidas a patógenos después de la introducción relativamente reciente de los carbapenemes para el tratamiento de infecciones bacterianas44. Por lo tanto, es posible que varios de los AME identificados en este estudio se vuelvan más prevalentes con el tiempo y, una vez presentes en contextos que facilitan la transferencia y la co-selección, no se puede excluir que complementen, o incluso reemplacen, algunos de los AME identificados en este estudio. genes de resistencia a aminoglucósidos establecidos.

Varios de los nuevos AME asociados a patógenos móviles identificados en este estudio estaban presentes en muestras antiguas, con genes de siete familias (C1, C4, E18, G5, H100, I80, I269) transportados por bacterias aisladas antes de 1980. Estos genes tienen Por lo tanto, han estado presentes en patógenos como Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae y Salmonella enterica durante al menos cuatro décadas sin llegar a estar lo suficientemente extendidos como para ser identificados como ARG. Una investigación más profunda de estas familias reveló que cada una mostraba una fuerte preferencia por un rango taxonómico estrecho de huéspedes (Bacillus spp., Listeria spp., Streptococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., S. enterica y Legionella spp., respectivamente). , lo que sugiere que carecen de los medios para difundirse de manera eficiente. Sin embargo, para cuatro de las siete familias AME identificadas en aislados antiguos (C1, E18, G5, I80), una pequeña proporción de genes estaba presente en patógenos evolutivamente distantes, lo que indica una transferencia horizontal de genes (Datos complementarios 3). Entre estos huéspedes evolutivamente distantes, la fecha de recolección más temprana confirmada fue 2006 y, por lo tanto, especulamos que estos genes pueden haberse asociado más recientemente con MGE que mejoraron su capacidad de transferencia más amplia. También es posible que estos genes, y otros AME encontrados en este estudio, se enfrenten a fuertes barreras que dificulten su diseminación45. A menudo, los ARG se asocian con un mayor costo de acondicionamiento físico. Esto depende en gran medida de la secuencia de nucleótidos del gen, donde la presencia de codones raros en el nuevo huésped puede reducir drásticamente la tasa de traducción y, por tanto, impedir una expresión suficientemente alta46. Por lo tanto, es posible que algunos de los AME identificados en este estudio no sean suficientemente beneficiosos y que la mayoría de las bacterias prefieran determinantes de resistencia a aminoglucósidos más rentables47.

Los más de 1 millón de AME previstos se agruparon en casi 8.000 familias de AME, de las cuales sólo una proporción muy pequeña (1,2%) se había caracterizado previamente. Esto demuestra la gran diversidad de AME, de los cuales muchos están presentes de forma latente en muchas comunidades bacterianas48. De hecho, los AME estaban presentes de manera ubicua tanto en bacterias ambientales como comensales, incluidas Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi y Cyanobacteria (Figura complementaria 5). Además, los genes predichos por los diferentes modelos mostraron claras preferencias taxonómicas, lo que sugiere que se originan a partir de diferentes filos bacterianos (Figuras complementarias 5, 7)25. Si bien la mayoría de los ARG en especies no patógenas pueden no presentar una amenaza inmediata, no es descabellado suponer que algunos de ellos podrían movilizarse y transferirse a patógenos en el futuro. En particular, además de los 50 nuevos AME asociados a patógenos móviles, identificamos 433 nuevas familias de AME adicionales asociadas con MGE, lo que sugiere que es posible que ya se haya producido la movilización de varios genes (Fig. 1d). Esto fue respaldado por el análisis filogenético que mostró indicaciones claras de eventos de transferencia horizontal en todos los árboles, lo que sugiere que no solo los AME clínicamente relevantes son móviles (Figura complementaria 5). Recientemente se ha descrito un resistoma muy diverso y parcialmente móvil para otros ARG, incluidos genes de resistencia a betalactámicos, macrólidos, tetraciclinas y quinolinas49,50,51,52. Esto enfatiza aún más que es necesario considerar la resistencia completa (incluidos los numerosos ARG que aún no se han encontrado en patógenos) para evaluar plenamente los riesgos futuros para la salud humana asociados con la promoción de la resistencia a los antibióticos.

La identificación de nuevos AME descritos en este estudio se basó en predicciones computacionales. Estos genes deben tratarse como supuestos ARG hasta que hayan sido validados experimentalmente. Incluso si la mayoría de los genes predichos estuvieran presentes en clados monofiléticos junto con genes de resistencia conocidos (Figura 5 complementaria), algunos de ellos podrían haber perdido recientemente su funcionalidad original. Sin embargo, la validación experimental mostró que el 86% de los genes probados proporcionaban una mayor resistencia en E. coli a al menos un aminoglucósido. Esto está en línea con estudios previos que utilizaron la misma metodología, en los que entre el 60% y el 90% de los genes analizados produjeron el fenotipo esperado49,50,51,52. Por lo tanto, este estudio proporciona más evidencia de que la predicción computacional se puede utilizar para expandir el resistoma más allá del número limitado de secuencias genéticas que están actualmente presentes en las bases de datos ARG. También argumentamos, con base en nuestros resultados, que la detección computacional de aislados bacterianos constituye el enfoque a gran escala más eficiente para identificar nuevos determinantes de resistencia potencialmente emergentes.

En este estudio, identificamos una gran cantidad de nuevos AME móviles transportados por especies patógenas, lo que demuestra que los métodos computacionales permiten la identificación de ARG potencialmente emergentes antes de que se generalicen. La validación experimental mostró una alta precisión para predecir nuevos determinantes funcionales de resistencia, y varios de los nuevos AME probados proporcionaron resistencia mucho más allá de los puntos de corte clínicos. La introducción de ARG nuevos y potentes constituye una grave amenaza para la eficacia de los antibióticos existentes y futuros1,2,3. Conocer qué ARG pueden convertirse en un problema clínico en el futuro es crucial para la implementación de medidas preventivas adecuadas que limiten su diseminación. También es vital para las metodologías basadas en secuenciación que hoy en día se utilizan de forma rutinaria en el diagnóstico53, el control de infecciones54 y la vigilancia55. De hecho, los resultados de este estudio muestran que las bases de datos ARG existentes son claramente limitadas y solo proporcionarán información sobre una pequeña parte del resistoma clínicamente relevante. De hecho, este único estudio casi duplica el número de variantes conocidas de los genes aac y aph que circulan en los patógenos. Por lo tanto, es imperativo que las bases de datos de referencia de los ARG se amplíen y aquí la predicción computacional ofrece un método preciso y escalable que puede complementar los enfoques más tradicionales.

Se crearon y optimizaron nueve modelos de Markov ocultos (HMM) de perfil utilizando fARGene v0.135 de la siguiente manera. Las secuencias de nucleótidos que representan los genes aac y aph se descargaron de ResFinder v4.020 y se tradujeron utilizando EMBOSS Transeq v6.5.7.056. Dado que se requieren diferencias mínimas para que algunos genes de resistencia a aminoglucósidos se consideren variantes diferentes57, las secuencias de proteínas se agruparon con una identidad de aminoácidos del 90 % utilizando USEARCH v8.01445 con parámetros '-cluster_fast -id 0.9'58 para reducir la redundancia.

Las secuencias de centroides que representan AAC GNAT, AAC no similares a GNAT y APH se alinearon por separado utilizando mafft v7.2359, con parámetros predeterminados. Los árboles filogenéticos se crearon a partir de las alineaciones utilizando FastTree v2.1.1060, con parámetros predeterminados. A partir de los árboles resultantes, se identificaron nueve subconjuntos de secuencias que se agruparon (Figuras complementarias 1, 2, 3). Estos subconjuntos se utilizaron para crear nueve HMM utilizando 'fargene_model_creation' de fARGene v0.135. De estos modelos, seis (denominados AF) representaban AAC (con el modelo C representando AAC (3) no similares a GNAT) y tres (denominados GI) representaban APH (Datos complementarios 1). Las secuencias que se desviaban de los nueve subconjuntos no podían incluirse en ningún modelo sin reducir gravemente su rendimiento y, por lo tanto, fueron excluidas.

Para cada modelo, la sensibilidad se estimó mediante una validación cruzada de exclusión. La especificidad se estimó utilizando un conjunto negativo de secuencias de proteínas que están evolutivamente cercanas al AME pero que no se han asociado con la resistencia a los aminoglucósidos. Para los seis modelos de AAC, la especificidad se estimó a partir de un conjunto de 374 secuencias que representan acetiltransferasas relacionadas evolutivamente, incluidos miembros de la familia GNAT de N-acetiltransferasas a la que también pertenecen la mayoría de las enzimas AAC. Para los tres modelos de APH, se utilizaron 60 secuencias que representan homólogos de homoserina quinasa II y macrólidos fosfotransferasas para estimar la especificidad (Datos complementarios 1). Para todos los modelos, se asignaron umbrales de puntuación de dominio con el criterio de que tanto la sensibilidad como la especificidad deberían ser lo más altas posible. Sin embargo, para garantizar una tasa baja de falsos positivos, la alta especificidad tuvo prioridad sobre la alta sensibilidad. Además, durante todo el proceso de creación del modelo, prestamos atención a cualquier superposición entre las secuencias predichas por diferentes modelos, y no encontramos dicha superposición para los modelos finales.

Se buscaron genes que codifican AME con fARGene v0.135 utilizando los nuevos HMM en todos los genomas bacterianos de NCBI Assemly (descargado en agosto de 2021). Para cada modelo, se crearon familias AME agrupando las secuencias de proteínas, junto con sus correspondientes secuencias de referencia de ResFinder, con una identidad de aminoácidos del 70% utilizando USEARCH v8.0.144558 con parámetros '-cluster_fast -id 0.7'. Se crearon nueve árboles filogenéticos a partir de secuencias de centroides representativas utilizando la metodología descrita en la sección anterior. Para cada centroide, se identificó el homólogo conocido más cercano aplicando BLASTx v2.10.161, utilizando una base de datos personalizada basada principalmente en ResFinder v4.020 pero aumentada con secuencias de CARD62. La puntuación de identidad obtenida se visualizó junto con los árboles utilizando ggtree v3.0.463.

Para cada una de las 7612 familias AME predichas, se recuperaron regiones genéticas de hasta 10 kb aguas arriba y aguas abajo de los genes en el grupo utilizando GEnView v0.164. Estos contextos genéticos se examinaron en busca de MGE, incluidos elementos conjugativos, integrones y secuencias de inserción (IS) y ARG conocidos. Los elementos conjugativos se identificaron traduciendo las regiones genéticas en los seis marcos de lectura usando EMBOSS Transeq v6.5.7.056 y examinando los contextos traducidos con 124 HMM de MacSyfinder CONJScan v2.065, usando HMMER v3.1b266. Se aplicó Integron Finder v1.5.167 a los contextos genéticos para identificar integrones. Las secuencias de inserción y los ARG móviles co-localizados se identificaron aplicando BLASTx v2.10.161 a los contextos genéticos. Para las secuencias de inserción, se utilizó una base de datos de referencia basada en ISFinder68,69 para encontrar la mejor entre los aciertos superpuestos ubicados dentro de 1 kb del AME previsto, con el criterio de aciertos que muestran >50% de cobertura y >90% de identidad de nucleótidos. Para los ARG co-localizados, se utilizó ResFinder v4.0 como base de datos de referencia20, con el criterio de aciertos que muestran >90% de identidad de nucleótidos.

La similitud entre las proteínas que abarcan cada familia y los AME conocidos se evaluó utilizando BLASTx v2.10.161 y la misma base de datos que durante el análisis filogenético. Cada familia de AME se clasificó como conocida o nueva según la puntuación de identidad más alta obtenida, donde se consideró conocida >70% de identidad de aminoácidos con cualquier ResFinder/CARD AME. Además, las especies hospedadoras patógenas dentro de cada grupo se identificaron mediante referencias cruzadas de las especies representadas con una lista de referencia basada en la base de datos PATRIC70. Finalmente, para cada familia AME, se recopilaron metadatos sobre los aislados del genoma del huésped del NCBI utilizando Entrez Direct v13.971,72.

Se seleccionaron genes representativos de 34 nuevas familias AME para su validación funcional. Junto con cuatro positivos (aph(9)-Ia [U94857], aac(3)-IIb [M97172], aph(3')-III [M26832], aph(3'')-Ib [M28829]) y dos Secuencias genéticas de control negativas (tet(A) [AF534183], dfrA1 [FJ591049]) obtenidas de CARD62, los genes se optimizaron con codones para E. coli utilizando la herramienta de optimización de codones en línea GenScript73 y se sintetizaron por Twist Bioscience (EE. UU.). Estos genes se enviaron preinsertados dentro de la región del sitio de clonación múltiple pBAD del vector plasmídico pBAD/myc-His B (Invitrogen, EE. UU.). A su llegada, el ADN liofilizado se resuspendió en agua libre de nucleasas hasta un rango de concentración final de 10 a 20 ng/μl (validado utilizando un fluorómetro Qubit 2.0 [Invitrogen, EE. UU.]) y se almacenó a -20 °C.

Se mezclaron aproximadamente 15 ng de cada muestra de ADN con 50 µl de células TOP10 de E. coli electrocompetentes y se transfirieron a cubetas de electroporación frías de 1 mm (Bio-Rad, EE. UU.). La electroporación se realizó a 1,7 kV durante 5,3 ms utilizando el Eppendorf™ Eporator™ (Eppendorf, Alemania). Las células transformadas se resuspendieron inmediatamente en 1 ml de medio SOC precalentado y se incubaron durante 1 hora a 37 °C mientras se agitaban a 300 rpm. Los transformantes se sembraron en placas sobre agar LB con y sin ampicilina suplementada con 100 µg/ml y se incubaron durante la noche a 37ºC. Los transformantes exitosos se identificaron como colonias individuales en placas suplementadas con ampicilina. El control sin plásmido no indicó crecimiento en estas placas, lo que confirma la presencia de plásmidos en las muestras clonadas. Una única colonia de cada muestra transformada se sembró en placas de agar LB suplementadas con 100 µg/ml de ampicilina, se incubó durante la noche a 37 °C y se almacenó a 4 °C al día siguiente.

La validación de los AME pronosticados se realizó mediante la prueba de difusión en disco74. Se seleccionaron ocho aminoglucósidos (kanamicina [K 30 µg], gentamicina [CN 30 µg], neomicina [N 30 µg], espectinomicina [SH 25 µg], netilmicina [NET 10 µg], amikacina [AK 30 µg], tobramicina [TOB 30 µg], estreptomicina [S 10 µg]), junto con dos controles negativos (tetraciclina [TE 30 µg] y trimetoprima [W 5 µg] [Oxoid, Reino Unido]). Se inoculó una única colonia de cada uno de los clones transformados en caldo LB suplementado con 100 µg/ml de ampicilina y se incubó durante la noche a 37ºC mientras se agitaba a 150 rpm. Al día siguiente, se inocularon 100 µl del cultivo nocturno en caldo LB fresco suplementado con 100 µg/ml de ampicilina y se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 6 h. Se añadió L-(+)-arabinosa (Sigma, EE. UU.) a cada caldo (0,1%) y la incubación continuó hasta que se alcanzó una medición de DO600 de 0,7. Luego, cada una de las muestras se extendió sobre placas de agar Mueller-Hinton suplementado con L-(+)-arabinosa al 0,1 %. Se añadió uno de cada antibiótico a las placas utilizando un dispensador de disco de antibióticos (Oxoid, Reino Unido). Las placas se incubaron a 30 °C, evitando así la formación de cuerpos de inclusión75, durante aproximadamente 18 h. Los resultados se obtuvieron midiendo las zonas de inhibición de cada antibiótico en las distintas muestras. El cribado por difusión en disco se repitió hasta un total de tres réplicas. La confirmación de los insertos clonados utilizados en los estudios de expresión se validó mediante secuenciación Sanger.

Dado que la cepa TOP10 de E. coli es resistente a la estreptomicina, excluimos seis AME probados que solo se esperaba que confirieran resistencia a este aminoglucósido (I26, I64, I81, I91, I270, I642), según el perfil de resistencia asociado con sus respectivos homólogo conocido más cercano. Los diámetros de las zonas de inhibición producidos por estos AME para los otros aminoglucósidos probados se informan en el material complementario (Figura complementaria 6, Datos complementarios 5).

Se realizó un análisis de enriquecimiento de filos para probar si los AME predichos por diferentes modelos tenían afiliaciones taxonómicas específicas. Para cada modelo, se contó el número de especies hospedadoras únicas de cada uno de los cuatro filos bacterianos principales (Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria) y se comparó con el número de especies del mismo filo presentes en la base de datos utilizando la prueba exacta de Fisher. Se consideró significativo un valor de p < 0,01.

Para determinar si los AME probados experimentalmente conferían una resistencia significativamente mayor en E. coli, se calcularon los valores de p utilizando una prueba t unilateral de dos muestras. Para cada gen, los diámetros de la zona de inhibición obtenidos de las tres réplicas se probaron frente a los diámetros de los controles negativos correspondientes (tanto controles con plásmido vacío como sin plásmido) para cada aminoglucósido analizado. Para las pruebas significativas (valor de p <0,01), el diámetro promedio de la zona de inhibición de las réplicas se comparó con los puntos de corte clínicos de EUCAST (amikacina, gentamicina, tobramicina) o los valores de corte epidemiológicos (ECOFF; neomicina)41 cuando estaban disponibles. Se consideró que los genes daban resistencia clínica cuando el diámetro promedio de la zona más una desviación estándar estaba por debajo del punto de corte clínico/ECOFF correspondiente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los genomas utilizados para este estudio están disponibles públicamente en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly. Los modelos creados y utilizados en este estudio están disponibles en https://github.com/fannyhb/fargene. Las secuencias de proteínas, secuencias de nucleótidos y metadatos correspondientes a los nuevos genes predichos en este estudio se enumeran en los Datos complementarios 2. Los datos sin procesar de las pruebas de difusión en disco se presentan en los Datos complementarios 5. Los datos de origen utilizados para generar las cifras se pueden encontrar en los Datos complementarios. Datos 6.

El código utilizado para el análisis del contexto genético está disponible en https://github.com/davidgllund/ARG_context_analysis_pipeline76.

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Esta investigación fue apoyada por el Consejo Sueco de Investigación (VR) (2018–02835, 2018-05771 y 2019–03482). Las fuentes de financiación no participaron en el diseño, análisis o interpretación de los resultados.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad Tecnológica de Chalmers.

Departamento de Ciencias Matemáticas, Universidad Tecnológica de Chalmers y Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

David Lund, Marcos Parras-Moltó, Anna Johnning & Erik Kristiansson

Centro de Investigación sobre la Resistencia a los Antibióticos (CARe), Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

David Lund, Roelof Dirk Coertze, Marcos Parras-Moltó, Fanny Berglund, Carl-Fredrik Flach, Anna Johnning, D. G. Joakim Larsson & Erik Kristiansson

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Instituto de Biomedicina, Academia Sahlgrenska, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

Roelof Dirk Coertze, Fanny Berglund, Carl-Fredrik Flach y Director General Joakim Larsson

Departamento de Sistemas y Análisis de Datos, Centro Fraunhofer-Chalmers, Gotemburgo, Suecia

Anna Johnning

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DL, FB, AJ, DGJL y EK diseñaron el estudio y desarrollaron el enfoque. DL creó y optimizó los modelos probabilísticos. MP-M. recopiló los datos y ejecutó el análisis fARGene. DL implementó el proceso de análisis computacional, incluido el análisis filogenético y el análisis del contexto genético. RDC y C.-FF realizaron la validación experimental. Todos los autores discutieron los resultados y sus implicaciones. DL y EK redactaron el manuscrito. Todos los autores editaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Erik Kristiansson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Emily Bordeleau y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Pei Hao y Gene Chong. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Lund, D., Coertze, RD, Parras-Moltó, M. et al. Un examen exhaustivo revela genes de resistencia a aminoglucósidos no descubiertos previamente en patógenos humanos. Común Biol 6, 812 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05174-6

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Recibido: 20 de enero de 2023

Aceptado: 24 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05174-6

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