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May 17, 2024

Transcripción inversa

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 11470 (2023) Cita este artículo 9845 Accesos 4 Detalles de Altmetric Metrics El procedimiento ilustrado en este artículo representa un nuevo método para el transcriptoma

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11470 (2023) Citar este artículo

9845 Accesos

4 altmétrico

Detalles de métricas

El procedimiento ilustrado en este artículo representa un nuevo método para el análisis del transcriptoma mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), que evita la necesidad de eliminar la posible contaminación del ADN. Comparado con las metodologías existentes, nuestro método es más preciso, más simple y más reproducible porque preserva la integridad del ARN, no requiere materiales y/o reactivos que se utilizan para la eliminación del ADN y además reduce el número de muestras que se deben tomar. como controles negativos. Este nuevo procedimiento implica el uso de un cebador específicamente modificado durante el paso de transcripción inversa, que contiene bases no coincidentes, produciendo así moléculas de ADNc que difieren del ADN genómico. Al utilizar el mismo cebador modificado en la amplificación por PCR, solo se amplifica el molde de ADNc, ya que el molde de ADN genómico es parcialmente heterólogo con respecto al cebador. De esta manera, la amplificación por PCR no se ve afectada por ninguna posible contaminación del ADN, ya que es específica únicamente del molde de ADNc. Además, refleja con precisión la concentración inicial de ARN de la muestra, que es propensa a cambios debido a diversos tratamientos físicos o enzimáticos comúnmente utilizados por las metodologías actuales para la eliminación de ADN. El método es particularmente adecuado para la cuantificación de transcripciones de ADN altamente repetitivas, como el ADN satélite.

El análisis cualitativo y/o cuantitativo de transcritos mediante amplificación por PCR es un método de elección tanto en la investigación de biología molecular como en el diagnóstico médico1. Se utiliza ampliamente para detectar y cuantificar muchos tipos diferentes de transcripciones, como ARN mensajero, ARN ribosomal, ARN no codificante, etc. Las aplicaciones más comunes incluyen el análisis de la expresión genética y la identificación precisa de un microorganismo en particular.

Para ser analizado adecuadamente, el ARN purificado se somete a un paso preliminar y fundamental de transcripción inversa, mediante el cual las moléculas de ARN se convierten en ADNc (ADN complementario) mediante la enzima transcriptasa inversa. De hecho, el ARN en sí no puede amplificarse directamente durante los pasos posteriores de la PCR y necesariamente debe convertirse en cDNA1. El principal problema de la mayoría de los protocolos utilizados actualmente radica en la frecuente contaminación del ADN, que es imposible de diferenciar químicamente a nivel estructural del ADNc mediante la enzima polimerasa durante la amplificación por PCR, lo que provoca resultados falsos positivos2,3,4,5. 6,7. Para superar esta limitación, todos los protocolos actuales incluyen un par de pasos de eliminación del ADN, tanto durante la purificación del ARN como en el posterior paso de transcripción inversa. En ambos casos el ADN sería eliminado, ya sea con la ayuda de filtros mecánicos específicos (columnas a base de sílice) o mediante digestión enzimática mediante una enzima específica, como la ADNasa I (Desoxirribonucleasa I)8. Sin embargo, estos tratamientos no son 100% efectivos para la eliminación del ADN, que a menudo permanece como contaminación del ADN2,3. Este es particularmente el caso del ADN altamente repetitivo que constituye una parte sustancial del genoma eucariota y a menudo se transcribe en niveles bajos. Además, hay que subrayar que cualquier procedimiento aplicado para reducir la concentración de ADN en la muestra provoca ciertamente también la reducción de la concentración inicial del propio ARN, molécula que es por su propia naturaleza inestable y fácilmente degradable.

Aquí presentamos un método novedoso para el análisis del transcriptoma mediante PCR, en el que el ADNc y el ADN se diferencian y, por lo tanto, se excluye la contaminación por este último, lo que produce resultados más precisos, confiables y reproducibles.

Los cebadores directos, inversos y modificados utilizados para probar el nuevo protocolo se ilustran en la Tabla 1. El cebador específico modificado difiere con respecto a los cebadores directos e inversos no modificados en sólo cuatro alteraciones de bases (mutaciones puntuales) distribuidas alternativamente con nucleótidos sin cambios y comenzando desde el Extremo 3' del cebador (marcado en negrita en la Tabla 1).

También probamos cebadores que se modificaron de otras maneras (de dos a seis transiciones/transversiones en el extremo 3', con y sin la alternancia antes mencionada), pero los mejores y más consistentes resultados se obtuvieron con 4 desajustes alternos en el extremo 3' durante 20-26 cebadores largos de pb. Por supuesto, para cebadores más largos se pueden incluir más mutaciones, pero en nuestra experiencia, cuatro desajustes demostraron ser un número necesario y suficiente de modificaciones para lograr los resultados esperados. En nuestro caso, los cebadores modificados alteraron la complementariedad entre el cebador y el objetivo, preservando al mismo tiempo la especificidad y la termodinámica de los propios cebadores. La lista de todos los cebadores diseñados se muestra en la Tabla 1.

Una cepa de Escherichia coli (AB1157) utilizada para probar la expresión de los genes ssb, sulA y recA contenía un plásmido multicopia, pID2, para una mayor expresión del gen ssb9. ssb (que codifica una proteína SSB esencial y conservada, que regula el metabolismo del ADN), sulA (bajo control SOS, que codifica el inhibidor SulA de la división celular) y recA (que codifica una recombinasa bacteriana conservada, RecA). Las bacterias se cultivaron en medio LB, con aireación, a 37 °C hasta alcanzar una DO600 ~ 0,4 y posteriormente se aisló el ARN de ellas.

El ARN se purificó mediante el kit RNeasy Plus Mini (Qiagen) que, según las instrucciones del fabricante, incluye un paso de eliminación del ADN genómico mediante extracción en columna en fase sólida. Las muestras tratadas de esta manera se indican como + DNasa I y aquellas no tratadas para la eliminación del ADN genómico se indican como – DNasa I.

Aproximadamente 1 μg de ARN, cuantificado mediante Quant-IT RNA utilizando un fluorómetro Qubit (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.), se transcribió de forma inversa utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT sin gDNA Eraser (+ RT/– DNase I) o con gDNA Eraser (+ RT/ + DNasa I) (Takara, Dalian, China) utilizando una mezcla de 0,2 µM de cebadores hexámeros aleatorios o específicamente modificados (del kit) para el análisis de expresión de ssb, sulA y recA, tanto para el método nuevo como para el actual. En resumen, a las muestras designadas + DNasa I se les eliminó el ADN mediante una columna a base de sílice durante el aislamiento de ARN y mediante un borrador de ADNg (tratamiento con DNasa I) durante el paso de transcripción inversa. Para todas las muestras, se prepararon controles negativos sin enzima transcriptasa inversa (-RT).

El procedimiento de dPCR basado en nanoplacas se realizó utilizando el instrumento QIAcuity 2-plex (Qiagen, Hilden, Alemania). La mezcla de reacción de dPCR se ensambló utilizando la mezcla maestra de PCR QIAcuity 3X Eva Green, una mezcla de cebador 10X (2 µM), agua libre de RNasa y una concentración fija de plantilla de ADNc en un volumen final de 15 µl por muestra. Después de una agitación precisa, se transfirieron 12 µl de la mezcla preparada a la nanoplaca de 8,5 K de 24 pocillos y se sellaron con un sello de goma de nanoplaca. Para el control de calidad de QIAcuity dPCR, el ensayo se replicó con diferentes cantidades de entrada de plantilla de ADNc (24, 12 y 6 ng), cuantificadas mediante Quant-IT ssDNA utilizando un fluorómetro Qubit (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). Las secuencias de cebadores para la detección de transcripciones de los genes ssb, sulA y recA se indican en la Tabla 1.

Los resultados de todas las muestras se obtuvieron utilizando una plantilla de 24 ng de entrada, excepto el análisis de expresión del gen ssb en el método actual, que se realizó utilizando una muestra objetivo diluida 60 × con respecto a las muestras utilizadas para el nuevo método debido a la presencia de plásmido multicopia que expresa ssb. gen (Fig. 2A).

La nanoplaca de 8,5 K da lugar a 8.500 particiones individuales en las que la plantilla se distribuye aleatoriamente. QIAcuity lleva a cabo un procesamiento de muestras totalmente automatizado, incluidos todos los pasos necesarios para el cebado de placas, el sellado de particiones, el termociclado y el análisis de imágenes. El protocolo de ciclado de amplificación consistió en 95 °C durante 2 min para el paso de activación enzimática y los siguientes 40 ciclos de 15 s. a 95 °C para desnaturalización, 15 s. a 60 °C para recocido, y 15 s. a 72 °C para extensión, concluyendo con el paso final a 40 °C durante 5 min. La luz fluorescente es emitida por particiones positivas que contienen una molécula objetivo, a diferencia de aquellas que no la contienen, las particiones negativas. Los datos se analizaron utilizando el software QIAcuity Suite V1.1.3 (Qiagen) y los resultados se expresaron como copias de ADNc/μl según los análisis de distribución de Poisson. Las particiones producidas por la máquina se asemejan al proceso de Poisson ya que los objetivos terminan en diferentes particiones de forma independiente y con una tasa fija. La distribución de Poisson proporciona probabilidades de eventos aleatorios enteros positivos. El parámetro clave de esta distribución es el valor esperado para estos eventos, lo que significa que es la probabilidad media de una proporción de un proceso de conteo o del proceso de conteo per se para el análisis dPCR. Además, QIAcuity tiene software integrado que puede cuantificar y producir estadísticas confiables. En nuestro caso la medida estadística que consideramos fue el intervalo de confianza de Poisson a un nivel del 95% que, cuando se representa gráficamente (barra de error), muestra si los eventos difieren o no con un 95% de confianza.

Se aisló ARN alfa satélite (ASAT) de la línea celular humana de cáncer de cuello uterino HeLa (obtenida de ATCC (EE. UU.) utilizando el kit RNeasy Plus Mini (Qiagen). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (ambos de Sigma, MA). EE. UU.), en atmósfera humidificada de 5% de CO2 y a 37 °C.) El ARN satélite TCAST1 se aisló de escarabajos adultos Tribolium castaneum utilizando el kit RNeasy Plus Mini (Qiagen) que incluye un paso de eliminación de ADN genómico mediante extracción en columna en fase sólida. Aproximadamente 1 μg de ARN, cuantificado mediante Quant-IT RNA usando un fluorómetro Qubit (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.), se transcribió inversamente usando el kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser (Takara, Dalian, China) en 10 μL de solución de reacción. , utilizando cebadores específicamente modificados para el análisis de expresión de ASAT y TCAST1. Para todas las muestras, también se prepararon controles negativos sin enzima transcriptasa inversa.

El análisis qPCR se realizó según el protocolo publicado previamente10,11. Los cebadores para el análisis de expresión del ADN satélite alfa humano se construyeron según la secuencia consenso satélite alfa12 y los cebadores TCAST1 según su propia secuencia consenso satélite13. La glucuronidasa β (GUSB-Gene ID: 2990) y la proteína ribosómica S18 (RPS18) se utilizaron como controles endógenos para la normalización en muestras humanas y de Tribolium, respectivamente, y se expresaron de manera estable sin ninguna variación significativa entre las muestras. Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo térmico: 50 °C 2 min; 95ºC 7 min; 95ºC 15 s; 60 °C 1 min durante 40 ciclos seguido de etapa de disociación: 95 °C durante 15 s; 60 °C durante 1 min; 95 °C durante 15 s; y 60 °C durante 15 s. La especificidad de la amplificación se confirmó mediante análisis de la curva de disociación y la especificidad de los productos amplificados se probó en gel de agarosa. En cada ejecución se incluyó control sin plantilla (NTC). Los datos posteriores a la ejecución se analizaron utilizando el software LinRegPCR v.11.1. que permite calcular la concentración inicial de amplicón en la muestra (“valor N0”). El valor N0 se expresa en unidades de fluorescencia arbitrarias y se calcula considerando la eficiencia de la PCR y la fluorescencia inicial. Se promedió el “valor N0” determinado para cada réplica técnica y los “valores N0” promediados se dividieron por los “valores N0” del control endógeno (Figs. 5B y 6B). En este artículo decidimos también mostrar la representación gráfica de los gráficos de amplificación de datos sin procesar de Delta Rn vs Cycle (Fig. 5A y 6A, Supl. Fig. 1).

Nuestro método propuesto, representado esquemáticamente en la Fig. 1, aprovecha el uso de un cebador modificado (cebador específico modificado, PSM) durante el paso de transcripción inversa del protocolo. Dicho cebador es específico para las moléculas de ARN que se van a cuantificar y su secuencia de nucleótidos está diseñada para carecer de una homología perfecta con el ADN molde retrotranscrito. Generalmente, es suficiente agregar algunos desemparejamientos con respecto a la secuencia original, preferiblemente ubicados muy cerca de la región terminal 3'-OH. Estas modificaciones hacen que el cebador sea parcialmente complementario a la secuencia objetivo, pero aún puede hibridarse a las temperaturas de 37 a 42 °C utilizadas durante el paso de transcripción inversa. Sin embargo, el PSM se disociará de la secuencia de ADN genómico parcialmente homólogo durante el paso de PCR, una vez que la temperatura de funcionamiento alcance alrededor de 60 °C. El objetivo de utilizar dicho cebador específico convenientemente modificado es lograr la amplificación específicamente a partir de un molde de ADNc evitando al mismo tiempo objetivos de ADN genómico. Se debe probar experimentalmente el número correcto de modificaciones a aplicar, su efectividad y las temperaturas de discriminación adecuadas para todos y cada uno de los transcritos a analizar, seleccionando aquellos parámetros que muestran tendencias de amplificación negativas y positivas hacia objetivos de ADN y ADNc, respectivamente. Esta fase de optimización representa un paso preliminar de nuestro método que permite la configuración de controles negativos y positivos y, ventajosamente, debe realizarse solo una vez, ya que siempre es válido para un amplicón específico y se puede aplicar a un número variable de réplicas. bajo diferentes condiciones experimentales. De hecho, en los protocolos actuales, lo ideal es preparar el control negativo (NC: – RT, sin transcriptasa inversa) para cada nueva muestra que se vaya a analizar, aunque el objetivo sea el mismo, debido a la eficacia aleatoria del tratamiento con ADNasa I. Usando un PSM podemos generar ADNc ligeramente diferente de su contraparte de ADN genómico, debido a los desajustes de nucleótidos presentes en la secuencia.

Ilustración esquemática del nuevo método. (A) Modelo básico del metabolismo del ácido nucleico de ADN a ADNc. La integración del cebador específico modificado en el ADNc mediante transcripción inversa lo convierte en una parte permanente de la secuencia. (B) Amplificación de secuencia diana mediante reacción en cadena de la polimerasa. El ADNc convertido mediante un cebador específico modificado se amplifica adecuadamente a cierta temperatura discriminante, mientras que los objetivos del ADN genómico se evitan con éxito.

Durante la fase siguiente a la transcripción inversa (Fig. 1B), la amplificación del ADNc por PCR se realiza utilizando el mismo cebador modificado (PSM) del paso anterior además de los cebadores específicos (SP) no modificados comenzando en la dirección opuesta. En consecuencia, el amplicón resultante es una copia del ADNc y no del ADN, debido a las temperaturas de hibridación específicamente selectivas que suelen oscilar entre 55 °C y 62 °C. Por lo tanto, con este procedimiento, no es necesario eliminar el ADN copurificado de la muestra de ARN ya que ya no es un objetivo competitivo y no afectará el resultado final del ensayo. De hecho, en determinadas condiciones experimentales podría resultar útil y ventajoso tener tanto ADN como ARN presentes juntos en la misma muestra si, por ejemplo, es necesario normalizar los resultados con respecto a la variación del número de copias del gen.

Nuestro nuevo método propuesto se puede utilizar en diversas investigaciones experimentales y, para los fines de este artículo, se ha probado analizando tres genes bacterianos de E. coli: ssb, sulA y recA (Figs. 2, 3 y 4), y dos satélites. Transcripciones de ADN: satélite alfa humano (ASAT) (Figs. 5 y 6, y Fig. 2 suplementaria) y satélite TCAST1 de Tribolium castaneum (Fig. 1 suplementaria).

Transcripción del gen ssb en células de E. coli en crecimiento exponencial que albergan el plásmido pID2 de sobreexpresión de ssb obtenido mediante dPCR utilizando el método actual (A) y el nuevo (B). Las columnas representan el número de copias/μl y la barra de error representada muestra si los eventos difieren o no con un intervalo de confianza de Poisson del 95 %.

Transcripción del gen recA en células de E. coli en crecimiento exponencial obtenidas mediante dPCR utilizando un método nuevo y actual. Las columnas representan el número de copias/μl y la barra de error representada muestra si los eventos difieren o no con un intervalo de confianza de Poisson del 95 %.

Transcripción del gen sulA en células de E. coli en crecimiento exponencial obtenidas mediante dPCR utilizando un método nuevo y actual. Las columnas representan el número de copias/μl y la barra de error representada muestra si los eventos difieren o no con un intervalo de confianza de Poisson del 95 %.

Gráfico Delta Rn vs ciclo del ADN satélite alfa aislado de células HeLa obtenidas mediante qPCR utilizando el método actual (A) y el nuevo método (B). + RT y – RT representan controles positivos y negativos, con y sin transcripción inversa, respectivamente.

Nivel de transcripción del ADN satélite alfa obtenido mediante qPCR utilizando el método actual (A) y el nuevo método (B). Las columnas muestran el promedio de 2 muestras cargadas diferentes en experimentos de qPCR realizados por triplicado. N0 representa el valor promedio normalizado de N0 para el satélite alfa. C representa muestras alfa con transcripción inversa y NC representa controles negativos sin transcripción inversa y M es un marcador de tamaño de 100 pb.

Los genes bacterianos son un buen modelo experimental para probar nuestro método porque no contienen intrones en su región codificante, eliminando la posibilidad de discriminar entre transcritos y el ADN según sus diferentes tamaños. Por tanto, la técnica podría aplicarse para probar la expresión de todos los genes organizados con un intrón corto o nulo (por ejemplo, genes virales).

La cepa bacteriana utilizada en esta prueba se transformó con un plásmido multicopia que porta un gen ssb9 clonado, que podría competir por la amplificación con el ADNc de ssb durante la cuantificación de los transcritos mediante PCR, a menos que se implementaran tratamientos adicionales con ADNasa I. Los resultados indicados en la Fig. 2 muestran una gran diferencia (más de 40 veces) en los niveles de transcripción ssb medidos por nuestro método, en comparación con el método utilizado actualmente. Este nivel realmente alto de secuencia ssb amplificada en el último enfoque, cuando no se llevó a cabo la transcripción inversa y el ADN se eliminó tanto en el aislamiento de ARN como en los pasos de RT (Fig. 2A), probablemente se deba a la baja eficiencia de eliminación de secuencias cerradas covalentemente. ADN plasmídico circular, lo que significa que es falso (es decir, no representa con precisión el proceso de transcripción) y en realidad es causado por contaminación del ADN.

Esta es probablemente una razón para todos los casos observados de altos niveles de amplificación de la secuencia ssb utilizando cebadores clásicos (Fig. 2A). Por el contrario, nuestro nuevo método amplificó la secuencia ssb sólo en aquellos casos en los que se realizó la transcripción inversa, es decir, cuando se creó el ADNc (Fig. 2B). El nivel de amplificación de la secuencia ssb no dependió de la eliminación del ADN (Fig. 2B), lo que confirma la insensibilidad de nuestro método a la presencia de ADN genómico (y plásmido). A continuación, cuantificamos la expresión de los genes recA y sulA, que están presentes como copias únicas en el genoma de E. coli. De acuerdo con el ensayo anterior, no se observó amplificación de la secuencia recA utilizando nuestro método a menos que el ADNc se creara mediante transcripción inversa (Fig. 3). El nivel de amplificación de la secuencia recA fue, nuevamente, independiente de la eliminación del ADN genómico de la muestra (Fig. 3). Por el contrario, el método actual, que utiliza cebadores estándar, mostró una señal falsa positiva incluso cuando se omitió el paso de transcripción inversa y el ADN genómico se eliminó (obviamente de forma incompleta) mediante el tratamiento con ADNasa I (Fig. 3).

Finalmente, el análisis de la expresión del gen sulA utilizando un cebador modificado estuvo de acuerdo con los ensayos anteriores ya que la amplificación de la secuencia sulA se produjo sólo después de la transcripción inversa, es decir, fue específica para el ADNc (Fig. 4). En consecuencia, no se observó ningún efecto después de la eliminación del ADN genómico (Fig. 4). Por el contrario, la amplificación de la secuencia sulA utilizando cebadores estándar fue muy diferente y no se eliminó incluso en situaciones en las que se eliminó el ADN genómico y no se realizó la transcripción inversa (Fig. 4); Teóricamente, la muestra – RT/ + DNasa I no debe contener ADNc ni ADN genómico.

Los resultados presentados demuestran claramente que nuestro método de usar un cebador modificado durante la síntesis de ADNc produce una señal de PCR específica de ADNc, que es independiente del ADN genómico y, por lo tanto, cuantifica con mucha más precisión la expresión génica en comparación con el método estándar comúnmente utilizado, que Desafortunadamente, no produce un control negativo real ya que siempre existe la posibilidad de que haya ADN contaminante en la muestra.

El ADN satélite representa uno de los mejores candidatos para demostrar la eficacia de nuestra metodología, ya que se trata de un ADN genómico no codificante altamente repetitivo, siempre presente en grandes cantidades en la muestra y, por lo tanto, difícil, si no imposible, de eliminar durante la purificación del ARN. .

El ADN satélite alfa es el ADN satélite humano más abundante, tiene 171 pb de largo y comprende hasta el 10% del genoma14. La Figura 5A muestra los resultados de qPCR obtenidos siguiendo el protocolo estándar actual (método antiguo) que implica la eliminación del ADN tanto durante la fase de purificación del ARN como de transcripción inversa. A pesar de ello, el ADN satélite alfa continúa persistiendo en las muestras de control negativo (-RT). Además, dado que no está organizado en exones e intrones, el ADN satélite no se puede discriminar del ADNc satélite en función de su longitud; por lo tanto, incluso el más mínimo rastro de contaminación del ADN a menudo produce resultados falsos positivos. Sin embargo, el nuevo método demostró con éxito la desaparición de la contaminación del ADN satélite alfa en los resultados de la amplificación qPCR (Fig. 5B, – RT), como se puede ver claramente también al cargar los amplicones en gel de agarosa (Supl. Fig. 2). ): El amplicón ASAT de 126 pb de largo está presente solo en muestras + RT (C: controles) con respecto a muestras – RT (NC: control negativo). Los mismos resultados podrían representarse como en la Fig. 6A (método actual) y la Fig. 6B (método nuevo), donde el "valor N0" es la concentración inicial de amplicón en la muestra y las columnas muestran el promedio de 2 muestras cargadas diferentes en experimentos de qPCR. realizado por triplicado (consulte la sección "Materiales y método").

El ADN satélite altamente abundante TCAST1 se ha caracterizado previamente como el satélite principal que constituye hasta el 30% del genoma del escarabajo Tribolium castaneum, organizando las regiones centroméricas y pericentroméricas de los 20 cromosomas10,13. Nuevamente, utilizando el nuevo método solo se amplificó el ADNc (+muestras RT) y casi nada de contaminación del ADN genómico se detectó en las muestras –RT (Supl. Fig. 1). Los resultados muestran claramente que son exactamente los mismos que los obtenidos con el ADN satélite alfa humano.

En conclusión, podemos afirmar que los resultados obtenidos mediante la aplicación de nuestro nuevo método de cuantificación de diferentes tipos de transcripciones son ciertamente más precisos, reproducibles y asequibles que los obtenidos con los protocolos utilizados actualmente. Esto se debe a que nuestro método es insensible a la contaminación del ADN (que normalmente da lugar a señales falsas positivas) y, por lo tanto, no es necesaria la eliminación previa del ADN molde. Además, omitir el paso de eliminación del ADN preserva eficazmente el ARN de la degradación. De esa manera se evitan las dos fuentes principales de inexactitud inherente en los análisis del transcriptoma.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Gracias a los estudiantes que trabajaron en el laboratorio, especialmente: Nunzia Santini y Alessandro Esposito.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Croata para la Ciencia: IP-2019-04-6915 a Ð. Ugarković e IP-2019-04-3790 a D. Đermić, así como por el Ministerio italiano de Educación, Universidad e Investigación (MIUR), FFABR2017, fondo de Inversiones en Investigación Básica (FIRB), por el Programa Internacional de Movilidad de Personal de Universidad de Nápoles Federico II a I. Feliciello y por la fundación ADRIS.

División de Biología Molecular, Instituto Ruder Boskovic, 10000, Zagreb, Croacia

Damir Đermić, Sven Ljubić, Alfredo Procino y Đurđica Ugarković

División de Biología Molecular, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Zagreb, 10000, Zagreb, Croacia

Maja Matulić

Departamento de Ciencias Estadísticas, Alma Mater Studiorum, Universidad de Bolonia, 40126, Bolonia, Italia

María Chiara Feliciello

Departamento de Medicina Clínica y Cirugía, Universidad de Nápoles Federico II, 80135, Nápoles, Italia

Isidoro Feliciello

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SI: Conceptualización, Análisis formal, Metodología, Validación, Redacción del borrador original. D.Đ., SL, MM: preparación de muestras, revisión de redacción y edición. AP y Đ.U.: Revisión y edición de redacción. MCF: Revisión de redacción y análisis estadístico.

Correspondencia a Đurđica Ugarković o Isidoro Feliciello.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Đermić, D., Ljubić, S., Matulić, M. et al. PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) sin necesidad de eliminación previa del ADN. Representante científico 13, 11470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38383-4

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Recibido: 05 de abril de 2023

Aceptado: 07 de julio de 2023

Publicado: 15 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38383-4

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