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Oct 21, 2023

ADP reducido desactivado

Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 888 (2023) Cite este artículo 23 Accesos Detalles de métricas La chaperonina CCT/TRiC se encuentra en el citosol de todas las células eucariotas y ayuda a las proteínas

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 888 (2023) Citar este artículo

23 Accesos

Detalles de métricas

La chaperonina CCT/TRiC se encuentra en el citosol de todas las células eucariotas y ayuda al plegamiento de proteínas de forma dependiente de ATP. Se sabe que la doble mutación heterocigótica T400P y R516H en la subunidad CCT2 causa amaurosis congénita de Leber (LCA), una retinopatía congénita hereditaria. Esta doble mutación también hace que la función de la subunidad CCT2, cuando está fuera del complejo CCT/TRiC, sea defectuosa en la promoción de la autofagia. Aquí, mostramos mediante análisis cinético transitorio y en estado estacionario que la doble mutación correspondiente en la subunidad CCT2 de Saccharomyces cerevisiae reduce la tasa de descarga de ADP durante la hidrólisis de ATP por CCT/TRiC. También informamos que la actividad ATPasa de CCT/TRiC es estimulada por un sustrato no plegado. Nuestros resultados sugieren que el estado cerrado de CCT/TRiC se estabiliza mediante la doble mutación debido a la tasa de salida más lenta de ADP, impidiendo así la salida de CCT2 del complejo que se requiere para su función en la autofagia.

La amaurosis congénita de Leber (LCA) es una distrofia retiniana hereditaria, responsable de aproximadamente el 20% de los casos de ceguera infantil1,2. Actualmente, el LCA está asociado con mutaciones en 38 genes. Algunas de las mutaciones ligadas a LCA más comunes se encuentran en genes que se expresan única o predominantemente en la retina o en el epitelio pigmentario de la retina, como los que codifican la guanilato ciclasa-1, la retinoide isomerasa, la inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa 1 y la retinol deshidrogenasa 121. ,2. Curiosamente, sin embargo, se informó que la doble mutación heterocigótica T400P y R516H en la subunidad CCT2 de la chaperonina CCT/TRiC expresada de forma ubicua también es causante de LCA3. La chaperonina CCT/TRiC, que se encuentra en el citosol de todas las células eucariotas, ayuda al plegamiento de proteínas de una manera dependiente de ATP4,5,6,7,8. Se compone de dos anillos oligoméricos apilados uno detrás del otro, cada uno con una cavidad en la que el plegamiento de proteínas puede tener lugar en condiciones protectoras4,5,6,7,8. Cada anillo de CCT/TRiC se compone de ocho subunidades distintas, CCT1 a CCT8, que están dispuestas en un orden fijo alrededor del anillo. CCT/TRiC circula entre un estado de apo abierto, que puede unir a los clientes a través de contactos de subunidades específicas, y un estado cerrado alcanzado después de la unión cooperativa de ATP y la hidrólisis en la que el cliente queda encapsulado4,5,6,7,8.

Se cree que la función de plegamiento de CCT/TRiC requiere el complejo oligomérico intacto, pero las subunidades individuales también pueden tener funciones de pluriempleo, como lo sugieren los primeros estudios9,10 tras el descubrimiento de algunas de ellas en el núcleo. Recientemente, por ejemplo, se informó que la subunidad monomérica CCT2 interactúa con miembros de la familia del marcador de autofagosoma ATG8, promoviendo así la degradación autofágica de agregados de proteínas sólidas11. Se descubrió que esta interacción estaba mediada por los residuos de CCT2 humanos VLL en las posiciones 503-505 y VIL en las posiciones 513-515, que quedan expuestos tras la disociación de la subunidad CCT2 del resto del complejo CCT/TRiC. La proximidad del sitio de la mutación R516H asociada a LCA a estos residuos que interactúan con ATG8 sugirió que puede causar enfermedades al interferir con la orientación de la membrana autofágica y la degradación de agregados sólidos. De hecho, ya se ha informado anteriormente de un vínculo entre el ACV y la autofagia deteriorada12. Se descubrió que ambas mutaciones, R516H y T400P, reducen la asociación de CCT2 con Atg811, pero el mecanismo por el cual esto es causado por la mutación T400P sigue siendo menos claro. Dado que la mutación T400P está en la hélice 14, que contiene un residuo aspártico catalítico conservado, se especuló11 que T400P altera la actividad ATPasa de CCT/TRiC y estabiliza su estado cerrado. La estabilización del estado cerrado impediría la disociación de la subunidad CCT2 del complejo, perjudicando así la autofagia. Aquí, probamos esta hipótesis realizando un análisis detallado de la actividad ATPasa de CCT/TRiC de Saccharomyces cerevisiae con las mutaciones T394P y R510H en la subunidad CCT2.

Los residuos T394 y R510 en S. cerevisiae CCT2, que corresponden a los residuos T400 y R516 en CCT2 humano, están ubicados en las hélices 14 y 18, respectivamente (Fig. 1a). Estas hélices, como el resto de CCT2, están altamente conservadas en humanos, levaduras y otros organismos (Fig. 1b). La comparación de la estructura crio-EM del CCT2 humano y la estructura cristalina del CCT2 de levadura, ambas en un estado unido a nucleótidos, muestra que son muy similares (Fig. 1c), como se esperaba dada la alta identidad de secuencia, y sugiere que los efectos de Las mutaciones en la actividad ATPasa en CCT2 de levadura pueden imitar las del CCT2 humano. Además, se descubrió que estas mutaciones interfieren con la autofagia en la levadura (Figura 1 complementaria), como se informó anteriormente para los humanos11. En conjunto, estos datos indican que el análisis de los efectos de estas mutaciones en la levadura CCT/TRiC puede proporcionar información sobre sus efectos en los humanos.

a Estructura cristalina de la subunidad de levadura CCT2 (PDB ID: 4V8R) en el estado unido a ADP que muestra los residuos mutados (rojo), las hélices 14 (cian) y 18 (oro) y ADP (verde). Se magnifica el sitio de contacto entre la hélice 14 y el ADP. Se puede observar que una mutación en la posición 394 puede tener un efecto alostérico sobre E489, que está en contacto con ADP, a través de S490. Una mutación en la posición 510 puede afectar al ADP mediante un movimiento de cuerpo rígido de la hélice 18. También se muestra D386 (rosa), que es un residuo catalítico conservado. b Alineación de las secuencias de la hélice 14 (arriba) y la hélice 18 y la hebra 25 (abajo) en la subunidad CCT2 de diferentes organismos. Las posiciones mutadas se resaltan en cian y otras posiciones conservadas en amarillo. La numeración corresponde a la levadura CCT2. Las identidades generales de secuencia de aminoácidos de la hélice 14, la hélice 18 y la cadena 25 de levadura y humana y la subunidad CCT2 completa son aproximadamente 78, 71 y 65 %, respectivamente. Las similitudes de secuencia correspondientes son aproximadamente 87, 92 y 80%, respectivamente. c Estructura crio-EM superpuesta de CCT2 humano (PDB ID: 7LUM) y la estructura cristalina de levadura CCT2 (PDB ID: 4V8R), ambas en estado cerrado. Las estructuras son muy similares, como lo indica una desviación cuadrática media de ~1,2 Å. Los paneles a y c se generaron utilizando Chimera versión 1.15. Se utiliza el código de una sola letra de aminoácidos.

Las actividades de ATPasa en estado estacionario de CCT/TRiC de tipo salvaje, los mutantes simples T394P y R510H y el mutante doble correspondiente se caracterizaron midiendo las tasas iniciales de hidrólisis de ATP en función de la concentración de ATP (Fig. 2). Las curvas para el tipo salvaje y los dos mutantes únicos, que tenían perfiles similares, se ajustaron a la ecuación. 1 para dos transiciones alostéricas. En el caso del tipo salvaje, se encontró que los valores de las constantes de unión de ATP aparentes, K1 y K2, eran 8,3 (±1,6) y 110 (±39) μM, respectivamente, y los valores de las constantes de Hill para el tipo salvaje. Se encontró que la primera y segunda transiciones, n y m, eran 1,5 (±0,3) y 3,0 (±1,9), respectivamente. Estos valores concuerdan excelentemente con los valores respectivos de 9,6 (±0,4) y 97 (±58) μM para K1 y K2 y los valores respectivos de 1,2 (±0,6) y 3,0 (±0,2) para n y m, que fueron reportado antes13. Se encontró que los valores de kcat para la hidrólisis de ATP por uno y ambos anillos eran 0,043 (±0,005) y 0,053 (±0,001) s-1, respectivamente y, por lo tanto, cercanos a los informados anteriormente13. En el caso del mutante único R510H, se encontró que los valores de las constantes de unión de ATP aparentes, K1 y K2, eran 7,1 (±2,4) y 31 (±4) μM, respectivamente, y los valores de las constantes de Hill para el Se encontró que la primera y segunda transiciones, n y m, eran 2,1 (±0,9) y 5,3 (±4), respectivamente. Se encontró que los valores de kcat para la hidrólisis de ATP por uno y ambos anillos de este mutante eran 0,10 (±0,03) y 0,150 (±0,002) s-1, respectivamente. En el caso del mutante único T394P, se encontró que los valores de las constantes de unión de ATP aparentes, K1 y K2, eran 8,9 (±3,4) y 66 (±24) μM, respectivamente, y los valores de las constantes de Hill, n y m, fueron 1,7 (±0,6) y 3,2 (±2,0), respectivamente. Se encontró que los valores de kcat para la hidrólisis de ATP por uno y ambos anillos de este mutante eran 0,11 (±0,03) y 0,150 (±0,003) s-1, respectivamente.

Las velocidades iniciales de hidrólisis de ATP por CCT/TRiC de tipo salvaje y los diferentes mutantes se midieron a diferentes concentraciones de ATP utilizando una concentración final de oligómero de CCT/TRiC de 20 nM. Los datos para CCT/TRiC de tipo salvaje (a) y los mutantes individuales (b) se ajustaron a la ecuación. 1 para dos transiciones alostéricas. Ver Materiales y Métodos para más detalles. Las barras de error representan errores estándar.

Sorprendentemente, sin embargo, la curva para el mutante doble tiene un pico pequeño pero reproducible a aproximadamente 150 μM de ATP que está ausente en los datos para los mutantes individuales (Fig. 2b) y no se ha informado antes para CCT/TRiC de tipo salvaje. Sin embargo, la curva para el doble mutante es cualitativamente similar a las curvas bifásicas del GroEL14 de tipo salvaje. En el caso de GroEL, la disminución de la actividad ATPasa a concentraciones más altas de ATP se ha atribuido a la lenta tasa de eliminación de ADP y, en consecuencia, se encontró que estaba ausente en el mutante GroEL E257A con una tasa de eliminación rápida de ADP15. La curva distinta del doble mutante en comparación con la de los mutantes simples está de acuerdo con el estudio de Minegishi et al. 3 que indicó que los individuos heterocigotos con ambas mutaciones sufren de LCA, mientras que los individuos con un alelo de tipo salvaje y un alelo mutante (T400P o R516H) no (aunque el doble mutante en nuestro trabajo contiene ambas mutaciones en ambos anillos (Figura complementaria 2). )). Dado el vínculo sugerido por estos resultados entre el ACV causado por la doble mutación y una tasa de desactivación lenta del ADP, decidimos probar más a fondo si la tasa de desactivación del ADP es realmente más lenta en el doble mutante.

Las actividades ATPasa de CCT/TRiC de tipo salvaje y del doble mutante se examinaron con más detalle mediante la realización de experimentos cinéticos transitorios. Se mezclaron rápidamente volúmenes iguales de CCT/TRiC y diferentes concentraciones de ATP usando un dispositivo de flujo detenido, y los cambios resueltos en el tiempo en la concentración de fosfato inorgánico tras la hidrólisis de ATP se siguieron midiendo el cambio en la fluorescencia de un enlace de fosfato marcado con cumarina. proteína (PBP)16. Para cada concentración de ATP, se promediaron de 5 a 10 trazas (cada una con 2000 puntos de datos) y se ajustaron a la ecuación. S14 en la Nota complementaria 1. Las trazas promedio de CCT/TRiC de tipo salvaje y el doble mutante consisten, como se observó antes17, en dos fases de explosión seguidas de una fase de retraso y luego una fase de estado estacionario, que se describen mediante tres fases respectivas. términos exponenciales y un término lineal en la ecuación. S14.

En la Fig. 3 se muestran gráficos de las velocidades y amplitudes de las dos fases de ráfaga para CCT/TRiC de tipo salvaje y el doble mutante. Tres líneas de evidencia indican que la tasa de salida de ADP del doble mutante es más lenta que la del doble mutante. el tipo salvaje. En primer lugar, se puede ver que las amplitudes de las fases de explosión del doble mutante son mayores que las del tipo salvaje (Fig. 3b). En el caso de una liberación rápida de ADP, la ronda inicial de hidrólisis de ATP, que no implica una liberación previa de ADP, no diferirá mucho de las rondas posteriores que requieren la liberación de ADP, lo que resultará en fases de explosión con amplitudes disminuidas. En segundo lugar, se puede ver que las tasas de las fases de explosión del doble mutante aumentan de forma hiperbólica al aumentar las concentraciones de ATP, mientras que las del tipo salvaje disminuyen (Fig. 3a). Estas dependencias crecientes y decrecientes de las concentraciones de ligando (ATP) son consistentes con la unión simple (o ajuste inducido) y los mecanismos de selección conformacional de la unión del ligando, respectivamente, como se informó antes para CCT/TRiC de tipo salvaje y se muestra para el doble mutante en la Fig. 4. La afinidad aparente del ligando en el caso de unión simple (o ajuste inducido) es mayor que para la selección conformacional18, lo que sugiere que la tasa de eliminación de ADP del doble mutante es menor que la del tipo salvaje. En tercer lugar, el ajuste de los datos en la Fig. 3a para el doble mutante y el tipo salvaje a las expresiones de las constantes de velocidad observadas (ver ref. 18 y leyenda de la Fig. 3) en casos de unión simple y selección conformacional, respectivamente, proporcionar estimaciones de las afinidades del ligando. En el caso del mutante doble, las afinidades de ATP correspondientes a las dos fases de explosión son similares y se encuentran en aproximadamente 7 µM, mientras que en el caso del tipo salvaje son menores (aproximadamente 27 y 250 µM), lo que indica nuevamente que la tasa de eliminación de ADP del doble mutante es menor que la del tipo salvaje. Aquí, hemos asumido que un aumento en la afinidad por el ATP indica un aumento también en la afinidad por el ADP como se observa comúnmente, por ejemplo, en respuesta a la concentración de potasio19.

Los valores de las constantes de velocidad observadas (a) y las amplitudes (b) para las dos fases de ráfaga (designadas 1 y 2) se obtuvieron ajustando las trazas promediadas a la ecuación. S14. Los datos en (a) para cada una de las constantes de velocidad observadas del doble mutante se ajustaron, de acuerdo con un mecanismo de unión simple, a kobs = kcat[ATP]m/([ATP]m + Kd), donde m y Kd son las constantes de disociación de Hill y ATP. Los datos en (a) para cada una de las constantes de velocidad observadas del tipo salvaje se ajustaron como antes17, de acuerdo con el mecanismo de selección conformacional, a kobs = k-1Kd/([ATP]m + Kd) + k1, donde k1 y k-1 son las constantes de velocidad directa e inversa para el cambio conformacional. Las barras de error representan errores estándar.

Ta y Tb designan diferentes subconjuntos de subunidades en el estado T. Para simplificar, se supone que Ta, Tb y R se unen a m, n y q moléculas de ATP, respectivamente, que luego sufren hidrólisis. Las dos fases de explosión reflejan la hidrólisis de ATP por los estados Ta y Tb, respectivamente.

La actividad ATPasa de GroEL es estimulada por sustratos no plegados, como la α-lactoalbúmina reducida y empobrecida en calcio20, pero no se ha informado un efecto similar para CCT/TRiC en el caso de ningún sustrato. Dado que la estimulación de la actividad ATPasa de GroEL por los sustratos parece deberse a un aumento en la tasa de salida de ADP15, razonamos que la actividad ATPasa del doble mutante CCT/TRiC podría estimularse más que la del tipo salvaje, ya que tiene una tasa de descuento de ADP más baja. Por lo tanto, las actividades de ATPasa en estado estacionario del CCT / TRiC de tipo salvaje y del doble mutante se midieron en función de la concentración de α-lactoalbúmina a una concentración fija de ATP de 300 μM (Fig. 5). Los resultados muestran que la actividad ATPasa de CCT/TRiC es estimulada por un sustrato proteico no plegado como en el caso de GroEL20 y que este efecto es de hecho mayor en el caso del doble mutante, proporcionando así más evidencia de que su ADP se desactiva. el ritmo es más lento. Los experimentos de dispersión dinámica de luz muestran que la unión de α-lactoalbúmina a CCT/TRiC de tipo salvaje y al doble mutante no conduce a su desestabilización (Figura complementaria 3).

Las velocidades iniciales de hidrólisis de ATP por el CCT/TRiC de tipo salvaje marcado y el doble mutante se midieron en función de la concentración de α-lactoalbúmina a una concentración fija de ATP de 300 μM. La concentración final de oligómero de CCT/TRiC fue de 20 nM. Los datos de cada variante se normalizaron según su actividad ATPasa en estado estacionario en ausencia de α-lactoalbúmina. Ver Materiales y Métodos para más detalles. Las barras de error representan errores estándar.

En resumen, los datos cinéticos en estado estacionario y transitorios reportados aquí indican que la tasa de salida de ADP de CCT/TRiC que contiene T394P/R510H en la subunidad CCT2 (que corresponde a la doble mutación causante de LCA en humanos) es más lenta que la de CCT/TRiC de tipo salvaje, lo que conduce a la estabilización del estado cerrado del doble mutante CCT/TRiC. Se calcula21 que la superficie enterrada de CCT2 en el estado cerrado CCT/TRiC (PDB ID: 4V8R) es aproximadamente 3600 Å2 más que en el estado abierto (PDB ID: 5GW4), lo que corresponde a aproximadamente 6 kcal mol-1 más de unión. energía22 en los estados cerrado versus abierto. Los mapas de contacto muestran que CCT2 también tiene muchas más interacciones entre subunidades en los estados cerrado frente a abierto (Figura complementaria 4). Por lo tanto, un estado cerrado de mayor duración debido a una tasa de salida de ADP más lenta impediría la salida de la subunidad CCT2 del complejo y perjudicaría su función fuera del complejo en la autofagia11. Se puede estimar que una tasa de salida de ADP dos veces más lenta, como lo indica el efecto de la α-lactoalbúmina sobre la actividad de la ATPasa (Fig. 5), reduce la cantidad de CCT2 libre en un factor de dos (Ec. S15 en la Nota complementaria 1). Es importante señalar, sin embargo, que el estado cerrado se alcanza después de la hidrólisis del ATP (como en nuestros experimentos) y no al agregar ADP.

No quedó claro en el trabajo anterior3 si los heterocigotos padecen LCA porque todas sus subunidades CCT2 contienen una de las dos mutaciones o porque una proporción (p. ej., 50%) de sus complejos CCT/TRiC contienen ambas mutaciones (Figura complementaria 2). Dado que los mutantes individuales en nuestro estudio no muestran tasas de desactivación de ADP alteradas y que solo los heterocigotos sufren de LCA, nuestros resultados indican que la tasa de desactivación alterada en el mutante doble que sugiere que es causante de LCA se debe a la comunicación entre anillos. entre las diferentes mutaciones. Es probable que dicha comunicación se vea facilitada por la interacción directa de la subunidad CCT2 en los dos anillos, pero aún es necesario establecer el mecanismo subyacente. Por lo tanto, la LCA causada por esta doble mutación en CCT2 puede ser un ejemplo tanto de un trastorno congénito de la autofagia23 como de una enfermedad alostérica. En el pez cebra, también se encontró que una perturbación diferente de la hélice 14 en CCT2 (L394H y eliminación de residuos en las posiciones 395-401) afecta el desarrollo ocular24. Queda por establecer si el efecto en el pez cebra, que se atribuyó a defectos del ciclo celular y a la muerte celular, también implica una autofagia y un alosterio entre anillos deteriorados.

La mutagénesis se llevó a cabo mediante clonación por RF utilizando el plásmido pET17b que alberga el gen que codifica la subunidad CCT2 de S. cerevisiae, seguido en sentido descendente por el casete de resistencia a kanamicina y la región no traducida 3' (UTR) del gen. Se utilizaron los siguientes cebadores directos mutagénicos:

T394P: 5'-CGTGTTGTCACAGCCAACAAAGGAAACAAG-3'

R510H: 5'-GCTGAAGTTCTACTACATGTGGATAACATCATCC-3'

junto con los respectivos cebadores inversos: 5'-GTAGAACTTCAGGCGGCTTC-3' y 5'-GGATGTGATGTGAGAACTGTATCC-3' para generar megacebadores para amplificar los plásmidos completos con las mutaciones deseadas. El megacebador para crear el plásmido con el doble mutante se generó utilizando el cebador directo mutagénico para T394P y el cebador inverso para R510H. Luego, los plásmidos se digirieron con XbaI y NotI-HF para generar fragmentos lineales que contienen el gen CCT2 con la mutación doble o una de las simples. Las mutaciones se introdujeron en el gen cromosómico de la subunidad CCT2 mediante recombinación homóloga transformando células haploides de levadura S. cerevisiae (cepa BJ2168) con estos fragmentos. En estas células, el gen cromosómico CCT6 se reemplazó con una copia que contenía una inserción en marco de la secuencia codificante del péptido de unión a calmodulina (CBP), seguida de un marcador seleccionable (URA3) aguas abajo del gen26. El genotipo de esta cepa es Mat a leu2, trp1, gal2, ura3-52, leu2-3, prb1-1122, pep4-3, prc467, CCT6∷CBP∷URA3. Las colonias que contenían las mutaciones deseadas se identificaron mediante la secuenciación del gen completo de CCT2. Se descubrió que las mutaciones tenían efectos relativamente pequeños sobre el crecimiento celular en condiciones normales (Figura complementaria 5).

Las células que contenían CCT/TRiC de tipo salvaje o los mutantes se cultivaron en 10 l de medio YPD que contenía 300 μg/ml de geneticina a 30 °C. Luego se purificó CCT/TRiC esencialmente como se describió anteriormente17. En resumen, los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón Hepes 300 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 200 mM, 35% de glicerol, EDTA 2 mM y DTT 4 mM. Luego, las células se lisaron en presencia de 0,01 mg/ml de quimostatina, 0,01 mg/ml de antipaína, 0,01 mg/ml de pepstatina A, 0,02 mg/ml de leupeptina y un cóctel inhibidor de proteasa (Apex Bio, K1007) diluido 1:500. El lisado celular se hizo girar a 17.600 g durante 30 min. Luego, el sobrenadante se pasó a través de un papel de filtro Whatman y se complementó con CaCl2 5 mM, LDAO al 0,01 % y solución de aprotinina (Sigma A6279) en una dilución de 1:500 y DTT 2 mM adicional. Luego, el filtrado se incubó durante la noche a 4 °C con perlas de calmodulina (GE Healthcare Calmodulin Sepharose 4B) que se habían equilibrado con tampón Hepes 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 1 M, CaCl2 2 mM, DTT 2 mM, LDAO al 0,01 % y 20% de glicerol (tampón EQ). Luego se empaquetaron las perlas en una columna y se descartó el flujo. Luego se lavó la columna con 70 ml de tampón EQ, 70 ml de tampón de lavado (idéntico al tampón EQ pero con CaCl2 0,2 ​​mM y NaCl 200 mM) que contenía ATP 5 mM y MgCl2 20 mM, y luego 130 ml de tampón de lavado (sin ATP ni MgCl2). ) para eliminar el ATP. Se tuvo cuidado de que el caudal no excediera los 0,2 ml/min durante el lavado. La elución se realizó con un tampón de lavado que contenía EDTA 10 mM (sin CaCl2). Todas las fracciones que contenían la proteína se cargaron en un gradiente de sacarosa y se centrifugaron a 112.700 g durante 64 a 68 h. Las fracciones del gradiente que contiene CCT/TRiC se combinaron, se concentraron a 500 µl y se cargaron en una columna de filtración en gel (GE Healthcare Superose 6 10/300 GL). Las fracciones que contenían proteína pura se combinaron y se intercambiaron tampón en una columna PD10 (GE Healthcare) por tampón Tris (pH 7,5) que contenía KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM y glicerol al 20%. Luego, la proteína se concentró, se dividió en alícuotas, se congeló instantáneamente y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.

Las tasas iniciales (en estado estacionario) de la hidrólisis de ATP se midieron como se describe16 monitoreando los cambios resueltos en el tiempo en la emisión de fluorescencia a 475 nm de la proteína de unión a fosfato (PBP) marcada con cumarina tras la excitación a 430 nm utilizando un fluorímetro PCI ISS. PBP se expresó cultivando células BL21 de E. coli, que albergan el plásmido pET22b que contiene el gen de PBP, hasta que se alcanzó una DO de 0,8 y luego añadiendo IPTG 0,5 mM. Luego, las células se cultivaron durante la noche, se recogieron mediante centrifugación a 11.920 g durante 15 minutos y luego se resuspendieron en 30 ml de tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), 1 U de ADNasa1, lisozima (100 µg/ml), 1: 100 inhibidor del cóctel de proteasa (Apex Bio, K1007), MgCl2 2 mM y DTT 2 mM. Las células resuspendidas se lisaron haciéndolas pasar a través de una prensa francesa a 1500 atm. Luego se eliminaron los restos celulares haciendo girar las células lisadas a 38.720 g durante 30 minutos y el sobrenadante se diluyó hasta un volumen final de 100 ml con tampón de resuspensión. Luego se cargó el sobrenadante diluido en una columna HiTrap Q HP que se había equilibrado con un tampón de resuspensión. Después de lavar la columna con 50 ml de tampón de resuspensión, la proteína se eluyó con un gradiente continuo de NaCl 0-200 mM en el mismo tampón utilizando un volumen de elución total de 250 ml. Las fracciones que contenían proteínas se recogieron y analizaron para determinar su pureza utilizando SDS-PAGE. Las fracciones que contenían PBP se combinaron, concentraron y almacenaron a -80 °C para uso futuro. El etiquetado de PBP se logró como antes16. Las soluciones de nucleótidos utilizadas en experimentos con PBP se trataron con trapeador de fosfato (7-metilguanosina 500 μM, 1 U de PNPasa) como se describe 16 y luego se eliminó la PNPasa filtrando la solución de nucleótidos en un concentrador Centricon YM-50. Las reacciones se llevaron a cabo a 25 °C en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía MgCl2 10 mM, KCl 50 mM, glicerol al 20% (v/v) y DTT 1 mM. La concentración de CCT/TRiC fue de 20 nM. Los cambios en la fluorescencia se convirtieron en cambios en la concentración de fosfato utilizando curvas de calibración construidas midiendo la fluorescencia de PBP marcada a diferentes concentraciones de fosfato. Los datos se ajustaron a la siguiente ecuación27 para dos transiciones alostéricas:

donde [S] es la concentración de sustrato (ATP), Vmax(1) y Vmax(2) son las tasas iniciales máximas respectivas de hidrólisis de ATP por un solo anillo, y por ambos anillos de CCT, n y m son los coeficientes de Hill. para la unión de ATP al primer y segundo anillo, respectivamente, y K1 y K2 son las respectivas constantes de unión aparente de ATP para el primer y segundo anillo.

La α-lactoalbúmina utilizada en los ensayos de ATPasa cinética transitoria y en estado estacionario se preparó esencialmente como se describió anteriormente19. En resumen, se preparó α-lactoalbúmina bovina desnaturalizada con ácido disolviendo 1,75 mg de la proteína en 2,5 ml de HCl 0,01 M e incubando durante 30 minutos. Luego se eliminaron los iones de calcio haciendo pasar la proteína desnaturalizada a través de una columna Sephadex G-25 PD-10, que había sido preequilibrada con HCl 0,01 M. Luego, la proteína empobrecida en Ca++ se pasó a través de otra columna G-25 PD-10, que se había equilibrado con tampón de reacción ATPasa que contenía DTT 1 mM. La concentración final de α-lactoalbúmina no plegada se determinó como se describe28.

Las reacciones se iniciaron mezclando volúmenes iguales de CCT/TRiC (oligómero de 35 nM) y PBP (8 μM) con diferentes concentraciones de ATP (o varias concentraciones de α-lactoalbúmina en concentraciones finales fijas de 20 o 180 μM de ATP) utilizando un equipo de fotofísica aplicada. Máquina de flujo detenido SX.17MV. Las reacciones se llevaron a cabo en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM y glicerol al 20 % en agua para HPLC (sin fosfatos) a 25 °C. La liberación de fosfato tras la hidrólisis de ATP fue seguida por una excitación a 430 nm y una medición de la fluorescencia de la PBP marcada con cumarina a longitudes de onda superiores a 455 nm (usando un filtro de corte). Se utilizó una longitud de trayectoria de 0,2 cm y el paso de banda de longitud de onda del monocromador de entrada se ajustó a 9 nm. Promediamos de 5 a 10 trazas (usando una base de tiempo dividida con 1000 puntos de datos en el primer segundo y 1000 puntos de datos en el tiempo restante) para cada concentración de ATP. Las trazas promediadas se ajustaron a la ecuación. S14 (Nota complementaria 1) utilizando Origen. Los cambios en la fluorescencia se convirtieron en cambios en la concentración de fosfato utilizando curvas de calibración construidas midiendo la fluorescencia de PBP marcada a diferentes concentraciones de fosfato. Se encontró que la pendiente de la curva de calibración depende del valor preciso del voltaje del fotomultiplicador. Por lo tanto, determinamos la dependencia del valor de la pendiente de la curva de calibración del voltaje del fotomultiplicador como se describe17 para que los datos de cada experimento pudieran convertirse apropiadamente.

Se empleó el instrumento Wyatt DynaPro Nanostar II para las mediciones DLS. Este instrumento utiliza dispersión de luz a 658 nm y un ángulo de dispersión de 90°. Se cargaron muestras de proteínas de 20 μL en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM y glicerol al 20% en una pequeña cubeta desechable para cada medición. Las mediciones se llevaron a cabo a 20 °C.

Las células que contienen CCT/TRiC o CCT/TRiC de tipo salvaje con la doble mutación T394P/R510H en la subunidad CCT2 se transformaron con el plásmido pRS315-CUP9-RNQ1-YFP, que dirige la expresión de RNQ1-YFP bajo el control del promotor CUP929. . Se recogieron colonias individuales y se cultivaron durante 24 h en medio leu sintético definido (SD) que contenía CuSO4 0,5 mM. Luego, las células se centrifugaron y se resuspendieron en medio SD-leu con o sin rapamicina 0,4 μg/ml. Luego, las células se cultivaron durante 4 h y se tomaron imágenes usando un microscopio Olympus IX83 acoplado a un escáner confocal de disco giratorio Yokogawa CSU-W1 con cámaras sCMOS dual prime-BSI 18 (Photometrix). Las imágenes de 16 bits se adquirieron con dos esquemas de iluminación de 30 ms de exposición cada uno: uno para campo claro y otro para fluorescencia verde (YFP). Para la fluorescencia verde, excitamos la muestra con un láser de 488 nm (Coherent 150 mW) y recolectamos luz a través de un filtro de emisión de paso de banda (525/50 nm, Chroma ET/m). Las imágenes se realizaron con un objetivo de inmersión en aceite con apertura numérica de ×60/1,42 (UPLSAPO60XO, Olympus). Después de la adquisición, las células se identificaron y segmentaron y su señal fluorescente se identificó utilizando scripts informados previamente en ImageJ30. Los montajes de células se obtuvieron utilizando guiones informados anteriormente31. La cantidad de material en las vacuolas se calculó utilizando ImageJ32 seleccionando áreas vacuolares y cuantificando la intensidad de la señal en un conjunto aleatorio de células a partir de las imágenes fluorescentes obtenidas.

En el caso de los experimentos de flujo detenido, se promediaron de 5 a 10 trazas para cada condición experimental y los datos se ajustaron a la ecuación. S14. Se obtuvieron buenos ajustes como lo indican las desviaciones aleatorias alrededor de cero de los residuos. En el caso de los ensayos de ATPasa en estado estacionario, todos los experimentos se llevaron a cabo al menos por duplicado. Las barras de error representan los errores estándar de las pendientes obtenidas al ajustar una ecuación lineal.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que sustentan las conclusiones de este trabajo se incluyen en el artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Las fuentes están disponibles en Figshare: https://figshare.com/s/b859a263cad277b3a7dc.

Huang, CH, Yang, CM, Yang, CH, Hou, YC y Chen, TC Amaurosis congénita de Leber: conceptos actuales de correlaciones genotipo-fenotipo. Genes (Basilea) 12, 1261 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumaran, N., Moore, AT, Weleber, RG y Michaelides, M. Amaurosis congénita de Leber/distrofia retiniana grave de aparición temprana: características clínicas, genética molecular e intervenciones terapéuticas. Hno. J. Oftalmol. 101, 1147-1154 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Minegishi, Y. et al. Las mutaciones de CCT2 evocan amaurosis congénita de Leber debido a la inestabilidad del complejo chaperona. Ciencia. Rep. 6, 33742 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horovitz, A., Reingewertz, TH, Cuéllar, J. & Valpuesta, JM Mecanismos de chaperona: ¿múltiples y (mal)comprendidos? Año. Rev. Biofísica. 51, 115-133 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Smith, TM y Willardson, BM Conocimientos mecanicistas sobre el plegamiento de proteínas mediante el complejo de chaperoninas eucariotas CCT. Bioquímica. Soc. Trans. 50, 1403-1414 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grantham, J. La chaperona molecular CCT/TRiC: un componente esencial de la proteostasis y un modulador potencial de la agregación de proteínas. Frente Genet 11, 172 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L. y Frydman, J. La gimnasia TRiC/CCT impulsada por ATP: una máquina de plegado de proteínas asimétrica con una historia de origen simétrica. actual. Opinión. Estructura. Biol. 55, 50–58 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Willison, KR La estructura y evolución del TCP-1 que contiene chaperoninas eucariotas y su mecanismo que pliega la actina en un resorte proteico. Bioquímica. J. 475, 3009–3034 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Roobol, A. & Carden, MJ Las subunidades de la chaperonina citosólica eucariota CCT no siempre se comportan como componentes de un complejo heterooligomérico uniforme. EUR. J. Celda. Biol. 78, 21–32 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Andersen, JS y cols. Dinámica del proteoma nucleolor. Naturaleza 433, 77–83 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ma, X. et al. CCT2 es un receptor de agrefagia para la eliminación de agregados proteicos sólidos. Celda 185, 1325-1345 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ragi, SD y cols. Las nuevas variantes heterocigotas compuestas de cambio de marco en el gen PROM1 dan como resultado amaurosis congénita de Leber. Puerto de primavera fría. Mol. Caso Stud. 5, a004481 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Shimon, L., Hynes, GM, McCormack, EA, Willison, KR y Horovitz, A. La alosteria inducida por ATP en la chaperonina eucariota CCT es abolida por la mutación G345D en CCT4 que hace que la levadura sea sensible a la temperatura para el crecimiento. J. Mol. Biol. 377, 469–477 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yifrach, O. & Horovitz, A. Cooperatividad anidada en la actividad ATPasa de la chaperonina oligomérica GroEL. Bioquímica 34, 5303–5308 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Danziger, O., Shimon, L. & Horovitz, A. Glu257 en GroEL es un sensor involucrado en el acoplamiento de la unión del sustrato polipeptídico a la estimulación de la hidrólisis de ATP. Ciencia de las proteínas. 15, 1270-1276 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brune, M., Hunter, JL, Corrie, JE y Webb, MR Medición directa en tiempo real de la liberación rápida de fosfato inorgánico utilizando una nueva sonda fluorescente y su aplicación a la ATPasa del subfragmento 1 de actomiosina. Bioquímica 33, 8262–8271 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Korobko, I., Nadler-Holly, M. y Horovitz, A. Análisis cinético transitorio de la hidrólisis de ATP por la chaperonina CCT/TRiC. J. Mol. Biol. 428, 4520–4527 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vogt, AD y Di Cera, E. ¿Selección conformacional o ajuste inducido? Una valoración crítica del mecanismo cinético. Bioquímica 51, 5894–5902 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Grason, JP, Gresham, JS, Widjaja, L., Wehri, SC y Lorimer, GH Configuración del temporizador de chaperoninas: los efectos del K+ y la proteína sustrato en la hidrólisis del ATP. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 105, 17334–17338 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yifrach, O. y Horovitz, A. Control alostérico mediante ATP de la unión de proteínas no plegadas a GroEL. J. Mol. Biol. 255, 356–361 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Krissinel, E. y Henrick, K. Inferencia de conjuntos macromoleculares a partir del estado cristalino. J. Mol. Biol. 372, 774–797 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen, J., Sawyer, N. y Regan, L. Interacciones proteína-proteína: tendencias generales en la relación entre la afinidad de unión y el área de superficie enterrada interfacial. Ciencia de las proteínas. 22, 510–515 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ebrahimi-Fakhari, D. et al. Trastornos congénitos de la autofagia: una nueva clase emergente de errores innatos del neurometabolismo. Cerebro 139, 317–337 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Minegishi, Y., Nakaya, N. & Tomarev, SI Invest La mutación en el gen cct2 del pez cebra conduce a anomalías del ciclo celular y muerte celular en la retina: un modelo de amaurosis congénita de Leber relacionada con CCT2. Oftalmol. Vis. Ciencia. 59, 995–1004 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Unger, T., Jacobovitch, Y., Dantes, A., Bernheim, R. y Peleg, Y. Aplicaciones del procedimiento de clonación libre de restricciones (RF) para manipulaciones moleculares y expresión de proteínas. J. Estructura. Biol. 172, 34–44 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Amit, M. y col. Mutaciones equivalentes en las ocho subunidades de la chaperonina CCT producen fenotipos de expresión celular y genética dramáticamente diferentes. J. Mol. Biol. 401, 532–543 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kafri, G., Willison, KR y Horovitz, A. Interacciones alostéricas anidadas en la chaperonina citoplasmática que contiene TCP-1. Ciencia de las proteínas. 10, 445–449 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gill, SC y von Hippel, PH Cálculo de coeficientes de extinción de proteínas a partir de datos de secuencia de aminoácidos. Anal. Bioquímica. 182, 319–326 (1989).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Douglas, PM y cols. El ensamblaje de amiloide dependiente de chaperona protege a las células de la toxicidad priónica. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 105, 7206–7211 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heidenreich, M. y col. Diseño de conjuntos de proteínas con diagramas de fases sintonizables en células vivas. Nat. Química. Biol. 16, 939–945 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dubreuil, B. y col. YeastRGB: comparación de la abundancia y localización de proteínas de levadura en células y bibliotecas. Ácidos nucleicos res. 47, D1245-D1249 (2019).

Artículo PubMed Google Scholar

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW NIH Image to ImageJ: 25 años de análisis de imágenes. Nat. Métodos 9, 671–675 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Agradecemos al Prof. Douglas Cyr por el amable obsequio del plásmido pRS315-CUP9-RNQ1-YFP y al Prof. Zvulun Elazar por sus útiles consejos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Minerva con financiación del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación. AIA recibió financiación de la subvención n.° 075-15-2021-1071 para el desarrollo de tecnologías de edición genómica para la innovación en biotecnología industrial del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia. AH agradece el apoyo del Centro Helen & Milton A. Kimmelman de Estructura y Ensamblaje Biomolecular y del Instituto Ilse Katz de Investigación en Ciencias de Materiales e Investigación de Resonancia Magnética. AH es titular de la Cátedra Carl y Dorothy Bennett de Bioquímica.

Estos autores contribuyeron igualmente: Mousam Roy, Rachel C. Fleisher.

Departamento de Biología Química y Estructural, Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, 7610001, Israel

Mousam Roy, Rachel C. Fleisher, Alexander I. Alexandrov y Amnon Horovitz

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AH concibió el proyecto y escribió el primer borrador. MR y RCF realizaron todos los experimentos. AIA participó en los experimentos de imágenes y el análisis de las células de levadura. MR, RCF, AIA y AH revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Amnon Horovitz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Koyeli Mapa y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Elah Pick y Anam Akhtar. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Roy, M., Fleisher, RC, Alexandrov, AI et al. Reducción de la tasa de pérdida de ADP por la doble mutación T394P/R510H de la levadura CCT2 que causa la amaurosis congénita de Leber en humanos. Común Biol 6, 888 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05261-8

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Recibido: 02 de abril de 2023

Aceptado: 20 de agosto de 2023

Publicado: 29 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05261-8

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