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Mar 23, 2024

CRISPR/Cas12a combinado con RPA para la detección de T. gondii en sangre entera de ratón

Parasites & Vectors volumen 16, Número de artículo: 256 (2023) Citar este artículo 280 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics Toxoplasma gondii es un protozoo oportunista ubicuo en humanos y

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 256 (2023) Citar este artículo

280 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Toxoplasma gondii es un protozoo oportunista que se encuentra en todas partes en humanos y animales. Puede invadir cualquier órgano humano y causar enfermedades graves, como oftalmopatía por toxoplasma, meningoencefalitis y necrosis hepática. La toxoplasmosis porcina es frecuente en China. Los sistemas CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) y Cas (proteína asociada a CRISPR) se utilizan ampliamente para la edición de genes y la detección de patógenos. Los diagnósticos basados ​​en CRISPR son ensayos moleculares que se han desarrollado para detectar parásitos con alta sensibilidad y especificidad.

Este estudio tuvo como objetivo establecer un método de detección rápida combinado CRISPR/Cas12a y RPA para T. gondii apuntando al gen B1 y al elemento repetido de 529 pb (529 RE). Los resultados de la detección podrían visualizarse mediante fluorescencia o tiras de flujo lateral (LFS). Se evaluaron la sensibilidad y especificidad del método y para la detección se utilizó sangre de ratón infectado con T. gondii.

Los resultados indicaron que el método establecido para la detección de T. gondii fue satisfactorio, con un límite de detección de 1,5 cp/μl para los dos loci. Además, el gen B1 podría detectar 1 taquizoíto por reacción, y el 529 RE podría detectar 0,1 taquizoíto por reacción, de forma consistente con los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada altamente sensible. El método fue adecuado para cepas, incluida RH, y no tuvo reacción cruzada con el ADN de otros protozoos con hábitos similares. Todas las muestras de sangre de ratones infectados con T. gondii fueron positivas para T. gondii 1, 3 y 5 días después de la infección (dpi).

Este estudio estableció un método de detección de ADN para T. gondii rápido, sensible y que ahorra tiempo y que tiene el potencial de ser una herramienta alternativa para la detección de T. gondii en el campo.

La toxoplasmosis es una enfermedad humano-animal causada por un parásito intracelular especializado, Toxoplasma gondii, con distribución mundial [1]. Toxoplasma gondii gondii puede infectar a todos los animales de sangre caliente, incluidos los humanos [2]. En personas inmunocompetentes, la infección por T. gondii puede causar síntomas similares a los de la gripe que persisten durante semanas o meses antes de resolverse. Sin embargo, las personas inmunocomprometidas, como aquellas con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), los ancianos y aquellos que toman medicamentos inmunosupresores, tienen un mayor riesgo de sufrir enfermedades graves e incluso morir después de una infección por T. gondii [3]. Las mujeres embarazadas infectadas con T. gondii también corren riesgo de sufrir toxoplasmosis congénita en el feto, lo que puede provocar una serie de resultados adversos, como aborto, malformaciones o muerte fetal [4]. Se ha informado que la tasa serológica positiva de T. gondii en humanos en algunas regiones de China llega al 23,41%, lo que indica que la infección está muy extendida en el país [5]. Además de su impacto en la salud humana, T. gondii tiene un impacto significativo en la cría de animales, con estudios que muestran que la seroprevalencia global de T. gondii en cerdos es del 19% [6]. La infección por T. gondii en cerdos puede presentar una variedad de síntomas, que incluyen fiebre, diarrea, edema pulmonar y aborto en cerdas. Dado que la carne de cerdo es la principal fuente de carne para los humanos, la toxoplasmosis porcina aumenta la posibilidad de infección humana por T. gondii. La prevención y el cribado de T. gondii son cada vez más importantes. Sin embargo, la falta de síntomas clínicos específicos de la toxoplasmosis plantea un desafío para el diagnóstico, lo que destaca la necesidad de desarrollar métodos de detección de T. gondii más eficaces.

La detección de Toxoplasma gondii gondii se puede lograr mediante una variedad de métodos, incluidas técnicas etiológicas, inmunológicas y moleculares. Los métodos etiológicos, como el frotis de líquido peritoneal y la tinción de cortes histológicos, requieren mucho tiempo y tienen una alta tasa de falsos negativos. Las pruebas inmunológicas, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), son los métodos más comunes para detectar la toxoplasmosis. Si bien ELISA es simple y rápido, los pacientes en el período ventana de infección pueden pasar desapercibidos y existen varios factores que interfieren, como el factor reumatoide [7]. Además, los pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) e hipogammaglobulinemia secundaria pueden producir resultados falsos negativos debido a su incapacidad para producir anticuerpos IgG [8]. En biología molecular, la tecnología PCR es la más utilizada. Burg et al. utilizó con éxito la tecnología de PCR para detectar ADN de T. gondii en la sangre utilizando el gen B1 como gen diana en el siglo XX [9]. El uso de genes conservados, como el gen P30 y el gen SAG1, ha tenido éxito en la detección de T. gondii [10, 11]. La PCR cuantitativa (Q-PCR) es un derivado útil de la PCR que se puede utilizar para análisis tanto cualitativos como cuantitativos. Sin embargo, la Q-PCR requiere instrumentos costosos y precisos, lo que limita su uso al laboratorio, lo que la hace inadecuada para aplicaciones de campo.

Además de la alta especificidad, la alta sensibilidad y la corta ventana de detección, la detección ideal de patógenos también debe garantizar la portabilidad y el bajo costo del equipo de detección. En los últimos años, la aparición de técnicas de amplificación isotérmica como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) [12, 13], así como el descubrimiento de Cas12a, Cas13a y Cas14 en el sistema CRISPR/Cas. familia [14,15,16], han proporcionado enfoques viables para las pruebas en el lugar de atención (POCT). RPA puede lograr una amplificación exponencial del ADN molde en poco tiempo y en un ambiente de temperatura convencional y eliminar la dependencia del instrumento de PCR. El sistema CRISPR/Cas ha demostrado potencial en la detección de patógenos, siendo el sistema Cas12a capaz de escindir de forma no específica otro ADN monocatenario en el sistema después de la escisión específica del ADN bicatenario mediante el ARNcr dirigido a la secuencia objetivo [17]. En 2018, Doudna et al. estableció el sistema transinformador CRISPR dirigido a endonucleasa de ADN basado en Cas12a (DETECTR), que se ha utilizado para detectar rápidamente patógenos como el SARS-CoV-2 y el virus de la peste porcina africana (ASFV) [14, 18, 19]. Además, se han aplicado métodos de detección basados ​​en CRISPR para la detección de Cryptosporidium parvum y Plasmodium [20,21,22], lo que indica el amplio potencial de CRISPR en la detección de parásitos.

El gen B1 de T. gondii, con 35 copias en el ADN genómico del parásito, se considera actualmente el gen más utilizado en el campo de la detección del ácido nucleico de T. gondii [7, 23, 24]. De manera similar, se cree que el fragmento del gen 529 RE, con una tasa de repetición que oscila entre 200 y 300 copias en el genoma de T. gondii, contribuye a mejorar la sensibilidad y especificidad de la detección [25]. En este estudio, desarrollamos un método de detección molecular para el gen T. gondii B1 y 529 RE utilizando la tecnología DETECTR recientemente desarrollada y comparamos su eficacia con la del enfoque de PCR anidada. Se utilizó el método establecido para detectar muestras de sangre de animales huéspedes. Demostramos que nuestro método se caracteriza por un alto nivel de simplicidad, velocidad y precisión y es para pruebas en el punto de atención (POCT), utilizando técnicas de visualización simples como colocar el tubo de ensayo en una caja oscura bajo luz ultravioleta en un ambiente al aire libre o aplicación de una tira de flujo lateral (LFS) para la lectura directa de los resultados a simple vista.

Las cepas RH, Pru, wh3 y wh6, utilizadas en la presente investigación, fueron proporcionadas generosamente por el Laboratorio Clave de Zoonosis de Anhui, Universidad Médica de Anhui. El ADN de C. parvum y Babesia se obtuvo del Instituto de Investigación Veterinaria de Shanghai de la Academia China de Ciencias Agrícolas. Además, Plasmodium se obtuvo de Chao Zhang del Departamento de Biología de Patógenos de la Universidad Médica de Anhui. Se compraron ratones BALB/c hembra de seis a ocho semanas de edad en el Centro de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Anhui.

El plásmido Cas12a (pMBP-LbCas12a) se adquirió de Addgene (plásmido n.º 113431). Los vectores de expresión que contienen sitios de escisión de proteasa N-terminal 10 × His-tag, MBP y TEV se transformaron en células receptoras Escherichia coli BL21 (DE3). Las células se cultivaron en medio LB a 37 ℃ hasta la fase de crecimiento logarítmico; Se añadieron 8 ml de células a 400 ml de medio LB a 16 ℃, 200 rpm y se incubaron durante la noche. Luego las células se recogieron y centrifugaron. El sobrenadante se descartó y se resuspendió en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, glicerol al 5% (v/v), TCEP 1 mM, PMSF 0,5 mM y lisozima 0,25 mg/ml, pH 7,5) y se lisó por ultrasonidos. El precipitado se eliminó por centrifugación a 10.000 rcf durante 1 h a 4 °C. El sobrenadante de proteínas se filtró después de la centrifugación utilizando un filtro bacteriano de 0,22 µm. El filtrado se añadió a una columna precargada de resina de purificación Ni-NTA (Sangon Biotech, Shanghai, China), elución lineal con tampón. Después de mantener durante la noche, se llevó a cabo la escisión de TEV a 4 ° C para eliminar la etiqueta 10 × His-MBP y la muestra se cargó en una columna de heparina (GE, Hi-Trap) para una purificación adicional para obtener la proteína Cas12a. El tampón se reemplazó con la solución de almacenamiento final para Cas12a (Tris-HCl 20 mM, NaCl 2,0 M, pH 8,5) para la concentración de proteínas mediante el dispositivo de filtración centrífuga Amicon® Ultra-4 (Millipore, China). Se utilizó el método BCA para la determinación de la concentración, la identificación se realizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (archivo adicional 1: Fig. S1), con almacenamiento a -20 °C.

Se identificaron secuencias del genoma de T. gondii conservadas y específicas utilizando el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), y la selección final fue el gen T. gondii B1 (GenBank: AF179871) y 529 RE (GenBank: AF146527) como genes objetivo. Después de que la empresa sintetizó el oligonucleótido de ADNss de 66 nt (archivo adicional 1: Tabla S1), el oligonucleótido de ADNss se transcribió en ARNss in vitro utilizando el kit de síntesis de ARN rápido de alto rendimiento HiScribeT7 (NEB, EE. UU.). El sistema de transcripción consistió en 10 µl de mezcla de tampón NTP, 2 µl de mezcla de ARN polimerasa T7 y 1 µg de oligonucleótido de ADN monocatenario, y se alcanzaron 20 µl con agua libre de ARNasa. La incubación se llevó a cabo a 37 ℃ durante 7 h. Después de la incubación, se agregaron 2 µl de DNasaI y se agregó agua hasta alcanzar un volumen de 50 µl. La plantilla de ADN se eliminó mediante incubación a 37 ℃ durante 15 min. El ARNcr resultante se obtuvo mediante purificación de ARN utilizando el kit de limpieza de ARN Monarch® (NEB, EE. UU.). Se debe prestar atención para evitar la contaminación por RNasa durante todas las operaciones. El producto purificado se usó para determinar la concentración y se dispensó en un refrigerador criogénico a -80 ℃ para su almacenamiento antes de su uso.

La suspensión que contenía los taquizoítos de T. gondii RH se centrifugó a 2000 rpm durante 5 min y se descartó el sobrenadante. El ADN de Toxoplasma gondii se extrajo utilizando el kit de ADN genómico TIANamp (Tiangen, China). Los genes diana se amplificaron mediante cebadores de PCR (archivo adicional 1: Tabla S2) y se purificaron con un kit de purificación de ADN (Axygen, China). El producto de purificación se insertó en el vector T-Vector pMD19 mediante clonación TA. Después de la transformación al estado receptor de DH5α, la extracción se realizó con el kit de extracción de ADN de pequeño volumen Axygen Plasmid (Axygen, China). La concentración se midió con NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, EE. UU.), se registró y luego se almacenó a -20 °C.

El ADN se extrajo después de contar 106 taquizoitos de T. gondii con una placa de recuento de células, y el ADN genómico se diluyó al doble con ddH2O para contener 105 ADN de taquizoitos por tubo a 10-1 ADN de taquizoitos para pruebas posteriores.

Se utilizó el kit de amplificación de ácidos nucleicos RPA (Hangzhou ZC, China) para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. El sistema de reacción total para la amplificación fue de 50 µl; Se agregaron 41,5 µl de solución de tampón A, 2 µl (10 µM) de cada cebador directo e inverso (archivo adicional 1: Tabla S3) y 2 µl de ADN molde a un tubo de unidad RPA que contenía polvo liofilizado con enzima; Se añadieron a su tapa 2,5 µl de solución tampón B. La tapa se cubrió, se invirtió y se mezcló 5 a 6 veces. El tubo de reacción se bañó en agua a 37 ℃ durante 30 minutos para obtener un producto de amplificación que podría usarse para ensayos CRISPR posteriores.

La gradilla metálica para tubos de PCR necesaria para las reacciones CRISPR se enfrió previamente en un refrigerador a -80 °C, después de lo cual se preparó el siguiente sistema en la gradilla para tubos de PCR enfriada: LbCas12a 1 μM, ARNcr 2,5 μM y 2 μl de tampón NEB 10 × 2.1, y finalmente se completaron 20 µl con agua libre de RNasa. A una incubación de diez minutos a 37 °C le siguió la adición de una sonda fluorescente de ADN 0,5 μM (5'-FAM-TTATTATT-Bio-3'). Tomando 18 µl del sistema de reacción anterior, se le agregaron 2 µl de producto de amplificación RPA y se monitoreó la fluorescencia en el canal FAM usando BioRad CFX96 para leer el valor de fluorescencia.

Se agregaron 2 µl aspirados de la muestra preamplificada completa al sistema de reacción de escisión CRISPR/Cas12a; Se incubaron 20 µl del sistema de reacción durante 1 h a 37 °C. Luego, se agregaron 80 µl de 1 × PBS y se mezclaron bien; Se aspiraron 100 µl a la almohadilla de muestra y se observaron los resultados después de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente.

Los cebadores de PCR anidados (archivo adicional 1: Tabla S4) se utilizaron como se informa en el artículo de Shirzad Fallahi et al. [26]. La longitud del producto de PCR anidado fue de 194 pb para el gen B1 y de 164 pb para el 529 RE. La primera ronda del sistema de reacción de PCR fue de 50 µl y contenía 10 µl de tampón PrimeSTAR 5 ×, 4 µl de mezcla de dNTP, 1 µl (10 µM) de cada uno de los cebadores ascendentes y descendentes, 1 µl de plantilla de ADN, 1 µl de ADN polimerasa Taq y 50 µl. µl preparado con ddH2O.

El procedimiento de amplificación fue el siguiente: la desnaturalización inicial se realizó a 95 °C durante 5 min, seguida de 34 ciclos de desnaturalización (10 s a 98 °C), hibridación (15 s a 56 °C) y extensión (60 s/ kb a 72 °C), al final del ciclo se extendió a 72 °C por 5 min. Los productos de la primera ronda se agregaron al sistema de la segunda ronda como plantilla de la segunda ronda, y el procedimiento fue el mismo que en la primera ronda. Los productos se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

El recuento se realizó utilizando una placa de recuento celular. A cada ratón se le inyectaron 1000 taquizoítos y al grupo de control se le inyectó el mismo volumen de solución salina. Se seleccionaron cinco ratones de cada grupo para tomar muestras de sangre ocular a 1, 3 y 5 ppp, y los ratones de control se diseccionaron y sacrificaron el último día. La sangre necesitaba ser anticoagulada, tras lo cual se extrajeron 200 µl de sangre anticoagulada para su análisis, utilizando muestras del grupo de solución salina como control negativo. El uso de animales fue aprobado por el Comité de Ética Animal Experimental de la Universidad Médica de Anhui.

En este estudio, desarrollamos un método de detección rápida de la infección por T. gondii combinando RPA y CRISPR/Cas12a (Fig. 1a). El método consta de tres sencillos pasos: extracción de ácido nucleico, amplificación de RPA y detección específica de CRISPR/Cas12a. Para aumentar la sensibilidad del método de detección de T. gondii, realizamos una comparación de objetivos, detección de cebadores y optimización del sistema. Para los objetivos B1 y 529 RE, diseñamos tres ARNcr para cada uno y evaluamos su desempeño en el sistema DETECTR mediante la evaluación de la intensidad de la fluorescencia. Finalmente, seleccionamos B1-L3 y 529 RE-L3 para detectar T. gondii (Fig. 1b). Para identificar los cebadores más eficientes para la amplificación de RPA, diseñamos tres cebadores directos e inversos para cada locus. Arreglamos los cebadores directos para descartar los cebadores inversos óptimos y de manera similar seleccionamos los cebadores directos (Fig. 1c, d). Optimizamos el sistema ajustando la concentración de proteína y ARNcr y determinamos que el mejor efecto de detección se lograba cuando la concentración final de proteína era de 5 μM y la concentración final de ARNcr era de 10 μM. Para reducir los costos del ensayo, elegimos utilizar una concentración final de Cas12a de 1 μM y una concentración final de crRNA de 2,5 μM, que se emplearon en experimentos posteriores (Fig. 1e).

Establecimiento de CRISPR/Cas12a combinado con RPA para la detección de Toxoplasma gondii. un flujo de trabajo DETECTR de T. gondii. b Comparación de diferentes ARNcr dirigidos a B1 y 529 RE mediante ensayo de fluorescencia. c Detección de cebadores RPA para B1-L3. d Detección de cebadores RPA para 529 RE-L3. e Optimización de la concentración de Cas12a y crRNA.

Evaluamos el límite de detección del ensayo DETECTR para T. gondii utilizando plásmidos recombinantes y descubrimos que la sensibilidad de detección para el gen B1 y 529 loci RE era tan baja como 1,5 cp/μl (Fig. 2a, b). En particular, las muestras positivas emitieron una fuerte fluorescencia de color amarillo verdoso bajo luz ultravioleta, que era observable a simple vista, lo que hace que este método sea particularmente adecuado para su uso en entornos con recursos limitados (Fig. 2a, b).

Sensibilidad del sistema DETECTR: (a) B1-DETECTR y (b) reacción 529 RE-DETECTR con estándares de plásmidos. El tubo muestra la señal de fluorescencia de la muestra bajo luz ultravioleta. 1 a 8 representan 3000 cp/μl, 300 cp/μl, 30 cp/μl, 3 cp/μl, 1,5 cp/μl, 0,3 cp/μl, 0,03 cp/μl, control negativo. c Reacción B1-DETECTR y d529 RE-DETECTR con ADN de taquizoitos de T. gondii. e PCR anidada B1 y reacción de PCR anidada f 529 RE con ADN de taquizoíto de T. gondii. 1 a 7 representan 10.000, 1.000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01 ADN de taquizoitos por reacción. ****P < 0,0001; ns, no significativo

Además, probamos el ensayo DETECTR utilizando diluciones en serie de ADN de taquizoíto y descubrimos que el límite de detección era 1 taquizoíto por reacción para B1 (Fig. 2c) y 0,1 taquizoíto por reacción para 529 RE (Fig. 2d); 529 RE fue más sensible que B1, tal vez porque 529 RE tiene entre 200 y 300 copias en el genoma de T. gondii, mientras que el gen B1 tiene solo 35 copias. Además, se descubrió que el ensayo DETECTR era comparable a la PCR anidada, ya que ambos métodos pudieron detectar 1 taquizoíto por reacción para B1 (Fig. 2e), mientras que 529 RE pudo detectar 0,1 taquizoíto por reacción (Fig. 2f). Estos resultados sugirieron que el ensayo DETECTR era un método sensible y confiable para la detección de ADN de taquizoitos de T. gondii, particularmente cuando se dirige al locus 529 RE.

Para investigar la universalidad del ensayo DETECTR para T. gondii, detectamos el ADN extraído de cuatro cepas diferentes, incluidas RH en el tipo I, Pru en el tipo II y las cepas wh3 y wh6 del genotipo chino 1. Los resultados revelaron que este método fue efectivo para las cuatro cepas, exhibió fuertes valores de fluorescencia y no hubo diferencias significativas en el efecto de detección entre las cuatro cepas (Fig. 3a, b).

Especificidad del sistema DETECTR: (a) reacción B1-DETECTR y (b)529 RE-DETECTR del ADN de cuatro cepas diferentes de T. gondii; Se pueden detectar las cuatro cepas. NC, control negativo. No se pudo detectar la reacción c B1-DETECTR y d529 RE-DETECTR de cuatro tipos de ADN del parásito, excepto el ADN de T. gondii. NC, control negativo; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns, no significativo

Además, seleccionamos Plasmodium, C. parvum y Babesia, que tienen hábitos o síntomas de infección similares a los de T. gondii, para una detección específica. El sistema DETECTR para T. gondii mostró positividad solo para el ADN de T. gondii, y los valores de fluorescencia de los otros tres protozoos fueron consistentes con los del grupo de control negativo (Fig. 3c, d). Este resultado también fue evidente bajo luz ultravioleta (archivo adicional 1: Fig. S2). Por tanto, el sistema DETECTR demostró una buena especificidad.

Hemos desarrollado un modelo murino de toxoplasmosis administrando 1000 taquizoítos RH por vía intraperitoneal a ratones BALB/c. Empleamos el sistema DETECTR para realizar una detección rápida de T. gondii en muestras de sangre completa recolectadas de ratones infectados. Nuestros hallazgos demostraron que el ADN de T. gondii se pudo detectar con éxito en todas las muestras de sangre obtenidas en 1, 3 y 5 ppp, mientras que el grupo de control negativo inyectado con solución salina produjo resultados negativos (Fig. 4a, c). También se realizó una PCR anidada en muestras de sangre de ratones infectados con 1000 taquizoitos RH, y todas las muestras fueron positivas a 1, 3 y 5 ppp, mientras que todas las muestras en el grupo de control fueron negativas (Fig. 4b, d). Nuestro estudio indica que el sistema DETECTR es capaz de detectar la infección por T. gondii en sus primeras etapas.

Resultados de análisis de muestras de sangre de ratones infectados con Toxoplasma gondii. una reacción B1-DETECTR y c 529 RE-DETECTR con ADN de sangre de ratón. 1 ppp, 1 día después de la infección, ratones #1; NS-1, solución salina normal nº 1; PC, control positivo; NC, control negativo; b PCR anidada B1 y reacción de PCR anidada d 529 RE con ADN de sangre de ratón. 1 a 15 representan muestras de sangre de ratón recolectadas 1, 3 y 5 días después de la inyección; 16 a 20 representan muestras después de la inyección de solución salina; 21 representa control positivo; 22 representa control negativo

En este estudio, combinamos el sistema de detección DETECTR basado en CRISPR/Cas12a con LFS para detectar el ADN objetivo. La tecnología LFS [27] utiliza el principio de inmunocromatografía tipo sándwich para detectar la presencia de ADN objetivo en una muestra (Fig. 5a). Específicamente, el LFS incorpora un área de unión de muestra, una línea de prueba y una línea de control. Los anticuerpos FITC acoplados a nanopartículas de oro se inmovilizan en la región de unión de la muestra, la línea de prueba se marca con estreptavidina y la línea de control se marca con anticuerpos anti-FITC. Después de agregar el sistema de reacción, la molécula indicadora de ADNss (FITC-TTATTATT-biotina) puede unirse al anticuerpo FITC acoplado a nanopartículas de oro como un complejo. Si es una muestra negativa, el complejo se captura en la línea de prueba y aparecerán ambas líneas; si es una muestra positiva, Cas12a se activa y escinde la molécula informadora, y la línea de prueba no captura el complejo; sólo se mostrará la línea de control. Si no se muestra ninguna o solo la línea de prueba, esto indica que la operación es incorrecta o la tira reactiva ha fallado, por lo que los resultados no son informativos. En general, el método desarrollado proporciona una herramienta prometedora para la detección portátil de ADN objetivo en diversos entornos.

Detección LFS basada en DETECTR de T. gondii. un principio de LFS. b B1-LFS yc 529 RE-LFS reacción con detección de especificidad. 1 a 5 representan Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Babesia, Plasmodium, control negativo. Reacción d B1-LFS y e 529 RE-LFS con ADN de sangre de ratón. 1 a 5 representan 5 días después de la inyección; 6 a 8 representan muestras después de la inyección de solución salina; 9 representa control positivo, 10 representa control negativo

En este estudio, evaluamos la sensibilidad y especificidad del método de detección LFS para el diagnóstico de infección por T. gondii utilizando el sistema de detección basado en CRISPR. Específicamente, mezclamos las muestras amplificadas con un sistema de detección CRISPR y las incubamos durante 1 h antes de realizar la LFS. Luego realizamos un ensayo de especificidad con el LFS y descubrimos que no hubo reactividad cruzada con otros parásitos, lo que indica la alta especificidad del método (Fig. 5b, c). Además, utilizamos el LFS para detectar T. gondii en muestras de sangre completa recolectadas de cinco ratones a 5 ppp. Sorprendentemente, todas las muestras fueron positivas para T. gondii y los resultados fueron consistentes con la detección de fluorescencia (Fig. 5d, e). Estos hallazgos demostraron en conjunto que el método de detección LFS mostró buena sensibilidad y especificidad para la detección de T. gondii y puede usarse como una herramienta prometedora para el diagnóstico preciso de la infección por T. gondii.

Hasta la fecha, no existe ningún fármaco terapéutico eficaz disponible para la infección por T. gondii. Por lo tanto, el desarrollo de un método de detección rápido y preciso de este patógeno es crucial para el control de la enfermedad y la prevención de su propagación. En este estudio, desarrollamos un nuevo enfoque de detección de T. gondii que combinó la tecnología RPA y CRISPR/Cas12a, utilizando fluorescencia o LFS como método de informe. Realizamos un análisis comparativo de la efectividad de los ensayos de PCR anidados y DETECTR dirigidos a B1 y 529 RE, respectivamente. Los resultados indicaron que DETECTR ofrecía una sensibilidad y especificidad comparables a la PCR anidada, pero era más fácil de usar debido a la falta de requisitos técnicos complejos. La reacción DETECTR se realizó a una temperatura constante de 37 °C y todo el proceso no requirió conocimientos técnicos complejos, lo que facilitó la detección rápida in situ del ADN de T. gondii en un breve lapso de tiempo.

En la actualidad, los métodos de detección de ácidos nucleicos para la identificación de patógenos implican principalmente tres etapas principales: procesamiento de muestras, amplificación de ácidos nucleicos y transducción e informes de señales. Los métodos de amplificación tradicionales, como la PCR y la Q-PCR, requieren mucho tiempo, hasta 2 horas o incluso más, y requieren ciclos térmicos. Aunque LAMP es un método de amplificación a temperatura constante, su diseño de cebador es complejo y la reacción de amplificación requiere incubación a 65 °C durante 1 h [28]. Por el contrario, el diseño del cebador RPA es simple y la reacción de amplificación se puede realizar a 37 °C durante sólo 20 a 30 minutos. Además, el sistema de transescisión CRISPR/Cas12a se puede activar a 37 °C y toda la reacción se puede realizar en un baño de agua, en una incubadora a temperatura constante o incluso en la palma de la mano. Los resultados se pueden leer bajo luz ultravioleta o mediante el uso de tiras de flujo lateral, lo que hace que la detección sea más factible en entornos fuera del laboratorio.

En esta investigación, se seleccionaron B1 y 529 RE como objetivos debido a su uso frecuente en la detección de ácidos nucleicos de T. gondii. Tras el reconocimiento del ADN bicatenario objetivo, se activó el sistema CRISPR/Cas12a, lo que llevó a una escisión masiva del indicador de ADN monocatenario, que sirvió como transductor de señal para convertir el reconocimiento del ADNds objetivo en bandas de fluorescencia o LFS [29 , 30]. La combinación del efecto de amplificación RPA y la tecnología DETECTR da como resultado una detección altamente sensible del ADN de T. gondii.

La sensibilidad de los ensayos DETECTR para la detección de plásmidos recombinantes diluidos en serie puede alcanzar 1,5 cp/μl. Para el ADN de taquizoitos de T. gondii, DETECTR puede detectar un mínimo de 1 taquizoito por el gen B1 (35 copias) y 0,1 taquizoitos por 529 RE (200-300 copias), siendo 529 RE una mejor opción que B1, como lo corrobora Shirzad Fallahi. y colegas [26]. En particular, la alta sensibilidad de la PCR anidada [31] para la detección de ADN de T. gondii es comparable a la de DETECTR, lo que indica que la tecnología DETECTR puede identificar bajas concentraciones de T. gondii en el medio ambiente. Además, al evaluar muestras de sangre total de ratones, DETECTR pudo detectar muestras positivas en 1 ppp y distinguir las muestras infectadas de las no infectadas. El método que hemos desarrollado es principalmente para la detección de muestras de sangre del huésped; La recolección de muestras de sangre es un proceso mínimamente invasivo o incluso no invasivo, a diferencia de las muestras de tejido, que pueden causar daño al huésped. Este método tiene el potencial de ser una herramienta de diagnóstico temprana y poderosa para el ADN de T. gondii.

La validación de la especificidad del ensayo DETECTR para la detección de T. gondii se realizó analizando el ADN de Plasmodium, C. parvum y Babesia, que son parásitos que tienen un desarrollo similar al de T. gondii (C. parvum) o pueden estar presentes. en muestras de sangre (Plasmodium, Babesia). En particular, todos los resultados fueron negativos para estos parásitos, con excepción de T. gondii, lo que confirma la alta especificidad del ensayo DETECTR para la detección de T. gondii.

En resumen, DETECTR es un método sencillo y rápido para detectar T. gondii que se puede aplicar en diversos entornos con recursos limitados. Además de la detección de animales infectados, también se puede realizar la detección de ADN de T. gondii en el medio ambiente, lo que tiene un gran potencial como alternativa a los métodos de detección actuales. Además de las ventajas anteriores, DETECTR tiene algunas limitaciones en la etapa de extracción de ADN. Se ha demostrado que los sistemas de detección de ácidos nucleicos basados ​​en CRISPR son compatibles con métodos que exponen rápidamente los ácidos nucleicos, como el calentamiento o la lisis química [32]. Por lo tanto, la investigación posterior se ha centrado en desarrollar técnicas para liberar rápidamente ADN de T. gondii de las muestras sin afectar la sensibilidad de detección, acortando así aún más el tiempo de detección. Debido a que existen genes diferenciales entre las cepas de T. gondii [33], lo que genera variaciones en la virulencia y la patogenicidad, los métodos de tipificación actuales se basan en la secuenciación y algunas técnicas derivadas de la PCR [34, 35]. Se pueden diseñar sgRNA específicos de cepa para apuntar a CRISPR, lo que puede ser particularmente beneficioso para identificar y tipificar genes de T. gondii. Además de su utilidad para detectar T. gondii, la tecnología DETECTR es muy prometedora para aplicaciones más amplias en la investigación de T. gondii.

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/material complementario; Se pueden dirigir más consultas al autor, Xiaofeng Wang: [email protected].

Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas

Proteína asociada a CRISPR

Elemento repetido de 529 pb.

Reacción en cadena de la polimerasa

Síndrome de Inmuno-Deficiencia Adquirida

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Leucemia linfocítica crónica

PCR cuantitativa

Amplificación isotérmica mediada por bucle

Amplificación de la recombinasa polimerasa

Reportero trans CRISPR dirigido a ADN endonucleasa

Pruebas en el lugar de atención

Centro Nacional de Información Biotecnológica

Franja de flujo lateral

Día post infección

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Descargar referencias

Agradecemos a Li Yu del Laboratorio Clave de Zoonosis de Anhui, Universidad Médica de Anhui, por proporcionar Toxoplasma gondii. Agradecemos al Instituto de Investigación Veterinaria de Shanghai, Academia China de Ciencias Agrícolas, por proporcionar ADN de Cryptosporidium parvum y Babesia. Agradecemos a Chao Zhang del Departamento de Biología de Patógenos de la Universidad Médica de Anhui, por proporcionar el Plasmodium.

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFC2301100).

Xiaofeng Wang y Miao Cheng contribuyeron igualmente a este trabajo.

El Laboratorio Clave de Microbiología y Parasitología de la Provincia de Anhui, el Laboratorio Clave de Zoonosis de Instituciones Superiores de Anhui, Departamento de Biología de Patógenos, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad Médica de Anhui, Hefei, China

Xiaofeng Wang, Miao Cheng, Shuqi Yang, Chen Xing, Qian Li, Yating Zhu y Yinan Du

Facultad de Ciencias Médicas Básicas, División de Ciencias de la Vida y Medicina, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, China

Yongsheng Ji

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Diseño de la obra: XW, CX, YJ, YD. Adquisición y análisis de los datos: XW, MC, SY, QL, YZ. Redacción del manuscrito original: XW. Supervisión del proyecto: YJ, YD. Adquisición de financiación: YD. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión enviada.

Correspondencia a Yongsheng Ji o Yinan Du.

Todos los experimentos con animales en este estudio han sido aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Anhui (n.º de aprobación LLSC20221092).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Expresión y purificación de proteínas. Gel de acrilamida teñido con azul de Coomassie. Figura S2. Especificidad de la reacción DETECTR. El tubo izquierdo representa B1-L3; el tubo derecho representa 529 RE-L3. Tabla S1. Secuencias de oligonucleótidos de ADNss. Tabla S2. Cebadores de PCR para la construcción de estándares. Tabla S3. Cebadores RPA. Tabla S4. Cebadores de PCR anidados

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.

Reimpresiones y permisos

Wang, X., Cheng, M., Yang, S. et al. CRISPR/Cas12a combinado con RPA para la detección de T. gondii en sangre completa de ratón. Vectores de parásitos 16, 256 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05868-0

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Recibido: 18 de abril de 2023

Aceptado: 04 de julio de 2023

Publicado: 30 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05868-0

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