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Jan 12, 2024

PCR

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1520 (2023) Cite este artículo 2265 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics Las pruebas rápidas altamente sensibles para COVID-19 son esenciales para minimizar el virus

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1520 (2023) Citar este artículo

2265 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

Las pruebas rápidas de alta sensibilidad para detectar la COVID-19 son esenciales para minimizar la transmisión del virus, especialmente antes de la aparición de los síntomas y en los casos asintomáticos. Aquí, presentamos herramientas de enriquecimiento diseñadas por bioingeniería para ensayos de flujo lateral (LFA) con sensibilidad y especificidad mejoradas (BEETLES2), logrando el enriquecimiento de los virus SARS-CoV-2, las proteínas de la nucleocápside (N) y la inmunoglobulina G (IgG) con una operación de 3 minutos. El límite de detección se mejora hasta 20 veces. Aplicamos este método a muestras clínicas, incluido el 83 % con cargas virales intermedias (35 %) o bajas (48 %), recolectadas de 62 individuos (n = 42 para positivos y n = 20 para controles sanos). Observamos una sensibilidad, especificidad y precisión diagnóstica del 88,1%, 100% y 91,9%, respectivamente, en comparación con los LFA comerciales que alcanzan solos el 14,29%, 100% y 41,94%, respectivamente. BEETLES2, con permselectividad y capacidad de ajuste, puede enriquecer el virus SARS-CoV-2, las proteínas N y la IgG en el hisopo nasofaríngeo/orofaríngeo, la saliva y el suero sanguíneo, lo que permite realizar pruebas confiables y sensibles en el lugar de atención, lo que facilita un diagnóstico temprano rápido. .

La detección y las pruebas rápidas de COVID-19 permiten la identificación de personas infectadas de alto riesgo y, en consecuencia, reducen la propagación del virus, proporcionando una mejor prevención y control de la COVID-191,2. La detección rápida y el tratamiento con una cuarentena adecuada son las mejores estrategias para afrontar las pandemias. Para las pruebas rápidas comerciales de COVID-19, hay 59 pruebas de diagnóstico de antígenos para el SARS-CoV-2 disponibles bajo Autorización de uso de emergencia (EUA) (a partir del 1 de enero de 2023)3. A pesar de las técnicas desarrolladas con un rendimiento diagnóstico avanzado4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) todavía se consideran el estándar de oro para COVID-19. diagnóstico. Aunque se puede realizar un ensayo de alta sensibilidad utilizando tecnologías de detección de ARN, realizar pruebas frecuentes de COVID-19 in situ es un desafío. La RT-qPCR tiene un costo elevado, un tiempo de operación prolongado (de 4 a 6 h) y tiempos de respuesta prolongados (hasta varios días)14,15,16,17. Además, la técnica RT-qPCR, altamente sensible y selectiva, requiere equipos de laboratorio costosos y pasos de extracción de ARN engorrosos, lo que limita su aplicación en pruebas en el lugar de atención (POCT)18. Los largos tiempos de respuesta permiten que las personas infectadas propaguen el virus de manera exponencial antes de obtener resultados, lo que limita el impacto del aislamiento y el rastreo de contactos8,19. Es importante destacar que las personas asintomáticas transmiten el virus a comunidades con una carga viral similar a la de aquellas que desarrollan síntomas20.

Para controlar la propagación de COVID-19, el mejor enfoque es la detección rápida y sencilla en el lugar al comienzo de la infección para detener la propagación con pruebas de alta frecuencia. A diferencia de la RT-qPCR que se prueba de forma rutinaria, la prueba de alta frecuencia debe ser de bajo costo y realizarse en el lugar de atención. Mina et al. ha afirmado que el mejor filtro de COVID-19 se puede lograr mediante pruebas frecuentes, de bajo costo, simples y rápidas porque el SARS-CoV-2 crece rápidamente y se propaga exponencialmente19. Una prueba RT-qPCR altamente sensible y monitoreada una sola vez puede detectar la diseminación viral mucho después del período infeccioso (aproximadamente 9 días), hasta 17 días21, es decir, la etapa de convalecencia con menos transmisión.

En cuanto a las pruebas de alta frecuencia para pruebas locales descentralizadas, la plataforma de ensayo de flujo lateral (LFA) se confirma como la mejor plataforma para pruebas automáticas y en el punto de atención, ya que proporciona un método desechable, de un solo paso, conveniente y fácil de usar. y resultados rápidos22. Las plataformas LFA se consideran las mejores candidatas ya que cumplen con los criterios “ASSURED” de la OMS (Organización Mundial de la Salud) (asequibles, sensibles, específicas, fáciles de usar, rápidas y robustas, sin equipos y entregables a los usuarios finales)23. El menor rendimiento del LFA limita la precisión, aumenta los falsos negativos y dificulta el diagnóstico temprano de COVID-19. Generalmente, la plataforma LFA muestra buena precisión para cargas virales elevadas; sin embargo, la precisión disminuye abruptamente con cargas virales bajas. Además, las pruebas LFA basadas en inmunoensayos son menos sensibles que la RT-qPCR de base molecular, lo que genera más falsos negativos y aumenta el riesgo de transmisión del virus. Recientemente, Chen et al. informaron sobre un inmunoensayo in situ cuantitativo y ultrasensible utilizando una membrana nanoporosa de óxido de aluminio anódico (AAO), que muestra la capacidad de enriquecer los virus del SARS-CoV-29. En general, las membranas de AAO se han considerado un material prometedor para facilitar la separación y el enriquecimiento según el tamaño24,25,26.

Aquí, desarrollamos herramientas de enriquecimiento de bioingeniería para LFA con sensibilidad y especificidad mejoradas (BEETLES2) combinadas con un kit comercial de LFA COVID-19. Un componente clave de BEETLES2 es una nanotrampa ajustable permselectiva que puede mejorar el rendimiento clínico de los LFA comerciales. Preparamos BEETLES2 con una combinación de membranas de glóbulos rojos (RBCM) y óxido de aluminio anódico nanoporoso (AAO). La combinación de un alto flujo de AAO y un canal de agua de acuaporina (AQP), a diferencia del enriquecimiento de membrana de AAO basado en el tamaño27,28, permite un transporte rápido de agua con permselectividad adicional en 3 minutos, logrando el enriquecimiento de los virus SARS-CoV-2, nucleocápside (N) proteínas y anticuerpos inmunoglobulina G (IgG). El límite de detección (LOD) se mejora hasta 20 veces. Además, mostramos una mayor sensibilidad, especificidad y precisión diagnóstica cuando se aplica a muestras de pacientes.

Demostramos el concepto clave de BEETLES2, que enriquece y separa biomoléculas en tamaños y cargas, y su aplicación para ensayos inmunológicos y moleculares (Fig. 1). Un filtro híbrido que consta de RBCM sobre una membrana AAO se llama membrana BEETLES2. En las siguientes secciones, describimos más detalles sobre el enriquecimiento sintonizable permselectivo de BEETLES2 con varios criterios como tamaño, carga y presión. La Figura 1a muestra un prototipo para la preparación de muestras POCT (detalles en la Fig. S1). Equipados con la membrana BEETLES2, enriquecimos las muestras objetivo y mejoramos los ensayos para POCT y diagnóstico molecular. Para las aplicaciones de COVID-19, nos centramos en el enriquecimiento de proteínas N, virus SARS-CoV-2 y anticuerpos IgG. La proteína N, una de las cuatro proteínas estructurales del virus SARS-CoV-2, es la proteína objetivo de la mayoría de los LFA Ag de COVID-19. Los anticuerpos IgG son las moléculas diana de COVID-19 Ab LFA. La Figura 1b muestra el protocolo de ensayo desde el muestreo hasta el ensayo. Después de la recolección de la muestra, enriquecimos la molécula objetivo mediante BEETLES2, aplicamos una herramienta de diagnóstico bien establecida, como LFA comercial y RT-qPCR, y mejoramos el rendimiento del ensayo (video complementario). Dado que BEETLES2 puede enriquecer proteínas N, virus SARS-CoV-2 y anticuerpos IgG, el LFA asistido por BEETLES2 permite el seguimiento diario de enfermedades infecciosas.

a BEETLES2, un filtro híbrido que consta de RBCM en una membrana AAO, tiene permselectividad y sintonizabilidad que permiten que las biomoléculas se enriquezcan con una función de separación. b Ensayo con BEETLES2 para inmunoensayo y ensayo molecular. Los dibujos animados de los paneles a, b se crearon con BioRender.com. BEETLES2, herramientas de enriquecimiento de bioingeniería para LFA con mayor sensibilidad y especificidad. Óxido de aluminio anódico AAO, ensayo de flujo lateral LFA, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa RT-qPCR, membrana de glóbulos rojos RBCM.

La principal ventaja de BEETLES2 es que la proteína viral y el virus en sí pueden enriquecerse con varios tampones, incluida la solución salina tamponada con fosfato (PBS), la saliva, el suero y el medio de transporte viral (VTM). Además se pueden eliminar abundantes proteínas (albúmina) y pequeños inhibidores. Las biomoléculas más grandes, como la IgG (~150 kDa), se enriquecen porque las proteínas más grandes no pueden atravesar libremente la membrana de BEETLES2. Curiosamente, observamos la permselectividad de la membrana BEETLES2 con las proteínas N (~ 46 kDa) y albúmina sérica bovina (BSA) (~ 66,5 kDa). La proteína N estaba cargada positivamente en condiciones fisiológicas, mientras que BSA estaba cargada negativamente. Por lo tanto, solo enriquecimos las proteínas N mientras que la BSA cargada negativa pasó libremente a través de la membrana de BEETLES2 y se filtró.

La Figura 2 presenta la caracterización física y química de la membrana BEETLES2. Se compone de RBCM y AAO, que son materiales híbridos clave para el enriquecimiento. Se utilizó como sustrato una membrana AAO nanoestructurada en forma de panal con un poro alineado de 20 nm (Fig. 2a). La membrana AAO en sí no tiene permselectividad y es responsable de la separación basada en el tamaño. Para agregar permselectividad sintonizable, funcionalizamos RBCM en la membrana AAO (Fig. 2b). Dado que el RBCM actúa como una barrera física, no observamos permselectividad sintonizable en la membrana BEETLES2 sin presión. Sin embargo, observamos una permselectividad sintonizable con una presión aplicada> 0,5 bar.

una membrana AAO con un poro alineado de 20 nm como sustrato, que no muestra permselectividad. b Funcionalización de RBCM en la membrana AAO, que muestra permselectividad y sintonizabilidad bajo presión aplicada. c Fabricación y análisis topológico de la membrana BEETLES2. d Imágenes AFM que muestran topografía y perfiles transversales de las imágenes del mapa de altura de la membrana desnuda AAO y BEETLES2. ( e, f ) Análisis KPFM de (e) imágenes de potencial de superficie de la membrana desnuda de AAO y BEETLES2 y f Frecuencias de potencial de superficie dependiendo de la concentración de RBCM (0-4% (v/v)). Los datos provienen de tres experimentos agrupados (0% RBCM, n = 30; 0,1-4% RBCM, n = 50). g El estudio FRAP de la intensidad de la fluorescencia con el tiempo y las imágenes que muestran RBCM en el sustrato están bien conservados, su difusividad lateral y fluidez en la deposición plana 2D y la recuperación de ~80 % del valor original se realizó en 150 s (radio del punto: 20 μm) . Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Los dibujos animados en los paneles a-c se crearon con BioRender.com. BEETLES2, herramientas de enriquecimiento de bioingeniería para LFA con mayor sensibilidad y especificidad; Óxido de aluminio anódico nanoporoso AAO, ensayo de flujo lateral LFA, membrana de glóbulos rojos RBCM, microscopía de fuerza atómica AFM, recuperación de fluorescencia FRAP después del fotoblanqueo, microscopía de fuerza con sonda Kelvin KPFM.

Funcionalizamos la membrana AAO con RBCM mediante el método de fusión de vesículas (Fig. 2c, Figs. S2 y 3). Las características conformacionales de la membrana de BEETLES2 se caracterizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y microscopía fluorescente. La membrana de AAO sin recubrir mostró una red similar a una malla, lo que ayudó a la penetración del agua y las proteínas. Por el contrario, la membrana BEETLES2 tenía una superficie lisa, lo que indica que la suspensión de RBCM cubrió completamente la estructura porosa y formó una estructura de RBCM multicapa (~1 μm en la membrana AAO, vista lateral).

A partir de las imágenes SEM (Fig. S4), observamos un recubrimiento conformado de RBCM con el menor defecto con una concentración de RBCM del 2%. 4% de RBCM también mostró recubrimiento conformado; sin embargo, ralentizó el transporte por agua en comparación con el 2% de RBCM. Para un análisis topológico adicional, medimos la rugosidad de la superficie de la membrana BEETLES2 dependiendo de la concentración de RBCM (0 - 4% (v/v)) mediante AFM (Fig. 2d, S5 y 6). En el área escaneada de 10 × 10 μm, la raíz de la superficie significa rugosidad cuadrática (Rq) de cada membrana BEETLES2 disminuyó significativamente en comparación con la de una membrana AAO desnuda, lo que indica un recubrimiento RBCM más conforme en la superficie de la membrana AAO.

Junto con el análisis AFM y SEM, realizamos microscopía de fuerza con sonda Kelvin (KPFM) (Fig. 2e, f y S7). A través de KPFM, medimos las caracterizaciones fisicoquímicas de la membrana de BEETLES2, que estaba cargada negativamente debido a los fosfolípidos cargados negativamente en RBCM29,30. Por el contrario, la membrana BEETLES2 con 4% de RBCM mostró una superficie relativamente cargada positivamente en comparación con la que tenía 2% de RBCM. Se especula que el flujo de corriente entre la punta en voladizo de KPFM y la muestra se ralentizó porque el RBCM no conductor estaba excesivamente envuelto en estado seco en la superficie de la membrana AAO31. Seleccionamos 2% de RBCM como la condición óptima porque un potencial superficial cargado negativamente de la membrana BEETLES2 es significativo para maximizar la interacción electrostática con la proteína de la nucleocápside cargada positivamente.

Para verificar la concentración óptima de RBCM, analizamos las imágenes fluorescentes con diferentes concentraciones de RBCM (0–4% (v/v)). Se intercalaron lípidos fluorescentes (PE-CF) en vesículas de RBCM y se recubrieron membranas de AAO. A continuación, se midieron las imágenes fluorescentes (Fig. S8). Según el análisis topológico, KPFM y datos fluorescentes, se determinó que la concentración de RBCM al 2 % era la mejor para la membrana BEETLES2. Además, validamos la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) y medimos la difusividad lateral y la movilidad de RBCM en la membrana AAO (Fig. 2g). La recuperación de fluorescencia a través de las manchas fotoblanqueadas (radio de la mancha: 20 μm) en el plano focal confirmó la formación de bicapas lipídicas móviles y contiguas en la membrana de AAO. Calculamos la fracción móvil (MF) y el coeficiente de difusión 2D (D) a partir de la recuperación de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo. La fluorescencia blanqueada se restableció gradualmente hasta aproximadamente el 80 % del valor original dentro de los 150 s posteriores a la eliminación con láser. Determinamos que el coeficiente de difusión traslacional de la membrana celular fue de 0,83 μm2 s-1, lo que coincide con los lípidos en glóbulos rojos intactos (D = 0,82 μm2 s-1)32,33. Este resultado indica que RBCM conserva su difusividad lateral y fluidez en la deposición plana 2D.

La Figura 3 valida el rendimiento de la membrana BEETLES2 para lograr un enriquecimiento permselectivo rápido con la ayuda de un transporte rápido de agua (flujo: 221,61 Lm–2 h–1). Además, las proteínas transportadoras de agua AQP en RBCM proporcionan una ruta clave para el enriquecimiento permselectivo (Fig. 3a)34. Clasificamos el enriquecimiento de la membrana BEETLES2 según la presión, el tamaño molecular, la carga y las condiciones del buffer. La membrana AAO tiene un tamaño de poro grande que permite el paso de diversas proteínas, como la albúmina, la proteína viral y la inmunoglobulina. Sin embargo, la membrana de BEETLES2 puede bloquear selectivamente estas proteínas porque la RBCM actúa como una barrera física. Curiosamente, con presión externa, las moléculas pequeñas y cargadas negativamente (p. ej., albúmina) pueden penetrar fácilmente la membrana de BEETLES2 debido a la alta movilidad de RBCM32,35.

a Diagrama de flujo que muestra la permselectividad y la capacidad de ajuste de la membrana BEETLES2 según la presión, el tamaño molecular, la carga y las condiciones del buffer. b Efecto de la presión sobre el enriquecimiento: BSA cargada negativamente con una fuerte dependencia de la presión, que muestra propiedades sintonizables bajo presión. c SDS-PAGE de BSA (PM: 66,5 kDa) d Enriquecimiento basado en el tamaño: Inmunoglobulina G (IgG). e SDS-PAGE de IgG (PM: 150 kDa) y Proteína N (PM: 46 kDa). f Enriquecimiento basado en carga superficial (permselectividad): el enriquecimiento con proteínas N cargadas positivamente. g Efecto de carga superficial (permselectividad): el enriquecimiento con BSA cargado positivamente (pI: 4,5~4,8) a un pH más bajo, mientras que no hay enriquecimiento a un pH más alto (condiciones neutras y con carga negativa). (h, j) Sensibilidad mejorada a través de BEETLES2 con (h) prueba COVID-19 Ag, (i) prueba rápida COVID-19 IgG y (j) prueba salival COVID-19 Ag. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. El panel a fue creado con BioRender.com. Medio de transporte viral VTM, electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio SDS-PAGE, herramientas de enriquecimiento de bioingeniería BEETLES2 para LFA con sensibilidad y especificidad mejoradas.

Primero, para dilucidar el efecto de la presión sobre el enriquecimiento en términos de sintonizabilidad, operamos BEETLES2 bajo varias presiones (Fig. 3b-f). La barra de error en la Fig. 3 representa la desviación entre ejecuciones (n = 3). Utilizamos NanoDrop y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para medir el enriquecimiento. Las proteínas BSA cargadas negativamente y N cargadas positivamente se probaron en condiciones fisiológicas. Con proteínas N cargadas positivamente, el enriquecimiento superó 24 veces lo medido por nanodrop independientemente de la presión (0,1 a 3 bar). Por el contrario, la BSA cargada negativamente mostró una fuerte dependencia de la presión (Fig. 3b). Especialmente para muestras de BSA con presión más baja (0,1 bar), se observó un aumento significativo en el enriquecimiento debido a la ausencia de permeación de BSA. La explicación más probable es la compresión de las células que permite la entrega de una diversidad de materiales36, lo que representa la necesidad de aplicar presión para la permeación de proteínas cargadas negativamente. Al aumentar la presión, la BSA pasó libremente a través de la membrana de BEETLES2', sin un enriquecimiento significativo. Es importante destacar que, con propiedades sintonizables bajo presión, eliminamos de manera eficiente la proteína más abundante, es decir, la albúmina y los pequeños inhibidores. A partir de SDS-PAGE, BSA se enriqueció a menos de 0,1 bar mientras pasaba a través de más de 1 bar, lo que confirma claramente la capacidad de ajuste del enriquecimiento bajo diferentes presiones (Fig. 3c).

En segundo lugar, demostramos el enriquecimiento de IgG, con un peso molecular (MW) de 150 kDa, el anticuerpo más común en la sangre y otros fluidos corporales (Fig. 3d). El seguimiento diario de IgG podría ser una prueba crucial para la convalecencia en COVID-19. Debido a la filtración por tamaño, enriquecimos la IgG hasta 18 veces independientemente de la presión aplicada (0,1 a 3 bar). Para validar el efecto del tamaño de la IgG, probamos fragmentos Fc de IgG humana (PM: 50 kDa) y no observamos ningún enriquecimiento de los fragmentos Fc de IgG a una presión de 3 bar, lo que infiere el efecto del tamaño de la IgG cargada negativamente en los enriquecimientos (Fig. S9). ). La presión se controló utilizando gas nitrógeno controlado por un regulador. Enriquecimos 3 ml de cada muestra en un volumen final de 100 µl, lo que teóricamente corresponde a un enriquecimiento de 30 veces. El enriquecimiento de IgG se confirmó bajo una presión de 3 bar (SDS-PAGE en la Fig. 3e). A diferencia de un ensayo basado en antígeno o virus, para las pruebas serológicas de diagnóstico rápido, solo se utilizaron 1 a 2 gotas (<100 µL) de sangre. Para manejar decenas de µL de muestras, se necesita un nuevo diseño. Uno de esos diseños posibles podría ser el sistema de microfluidos integrado en membrana BEETLES2.

En tercer lugar, verificamos el efecto de la carga superficial sobre la permselectividad y el enriquecimiento de biomoléculas (Fig. 3f). En condiciones fisiológicas, las proteínas N (PM: 46 kDa) con puntos isoeléctricos (pI) de 10,3 a 10,7 exhibieron una carga positiva general, mientras que BSA (PM: 66,5 kDa) tenía un pI de 4,5 a 4,8, lo que llevó a una carga negativa. La presión aplicada fue de 3 bar. Con un peso molecular similar, el enriquecimiento sólo con proteínas N fue de aproximadamente 24,16 veces, mientras que BSA no mostró un enriquecimiento significativo. A diferencia de las propiedades sintonizables de la BSA cargada negativamente entre enriquecimiento y separación con presión, las proteínas N cargadas positivamente solo mostraron enriquecimiento sin sintonizabilidad. Estos resultados indican que la membrana BEETLES2 bloquea completamente la penetración de proteínas cargadas positivamente a través de los filtros mediante la interacción electrostática de fosfolípidos cargados negativamente y proteínas virales cargadas positivamente en condiciones fisiológicas37. Las muestras de proteína N enriquecidas se adquirieron después de 3 minutos de operación BEETLES2 (SDS-PAGE en la Fig. 3e). Por el contrario, no se observó enriquecimiento por BSA en la zona de enriquecimiento después de 3 minutos.

Para verificar el efecto de la carga superficial sobre el enriquecimiento, que representa la permselectividad, controlamos la carga superficial de BSA (Fig. 3g). Realizamos mediciones de absorbancia de A280 utilizando NanoDrop para definir el factor de enriquecimiento. En condiciones de pH inferiores al valor de pI de BSA (pI: 4,5–4,8), la carga superficial general fue positiva. A pH 3-4, en condiciones de carga positiva, la BSA se enriqueció hasta 18,2 veces. Curiosamente, el factor de enriquecimiento disminuyó abruptamente cerca del valor pI, donde la carga general parecía neutral. La explicación más probable para el enriquecimiento es la fuerza electrostática entre la proteína cargada positivamente y la membrana BEETLES2 cargada negativamente. A un pH más alto, la carga global de BSA fue negativa. Por tanto, no se observó una disminución significativa en el factor de enriquecimiento.

La Figura 3h muestra la sensibilidad mejorada de COVID-19 Ag usando BEETLES2. En comparación con un LFA comercial (AllCheck COVID-19 Ag, Calth Inc., República de Corea) sin enriquecimiento con BEETLES2, todas las señales colorimétricas a través de BEETLES2 aumentaron, lo que indica una mayor sensibilidad de detección. Preparamos siete concentraciones diferentes diluyendo proteínas N con un tampón PBS y analizamos tres muestras para cada punto. El LOD se mejoró hasta 20 veces después del enriquecimiento de BEETLES2.

Para validar la versatilidad del ensayo COVID-19, realizamos la prueba rápida COVID-19 IgG (Fig. 3i). De manera similar a la prueba COVID-19 Ag, observamos una mayor sensibilidad mediante el proceso de enriquecimiento de la muestra. La prueba se realizó tres veces por punto para siete concentraciones diferentes. En consecuencia, el LOD aumentó hasta 20 veces después del enriquecimiento de BEETLES2, lo que muestra una gran aplicabilidad en el ensayo LFA. Confirmamos que BEETLES2 podría enriquecer las proteínas N y la IgG, que son los objetivos principales de la prueba del SARS-CoV-2. Además, es probable que BEETLES2 pueda aplicarse a otros virus diana, como la gripe A/B, ya que sus proteínas N y propiedades IgG son similares a las del SARS-CoV-2. Para validar la aplicabilidad de BEETLES2 a otros virus, realizamos una prueba rápida de influenza (Fig. S10). Utilizamos el antígeno de influenza A (Shangdong/9/93(94/516, NIBSC, Reino Unido) y B (Wisconsin/1/2010 (derivado de células) (12/110, NIBSC, Reino Unido) con sus kits rápidos (SGT i -flex Influenza A&B, Sugentech, República de Corea) Similar a la prueba COVID-19 Ag, adquirimos una señal colorimétrica mejorada mediante el proceso de enriquecimiento de la muestra.

Para demostrar la viabilidad del ensayo de saliva, realizamos el ensayo de Ag COVID-19 utilizando muestras de saliva (Fig. 3j). Las proteínas N se agregaron a la saliva artificial en siete concentraciones diferentes. Como el LFA comercial no se optimizó para el ensayo salival, los datos colorimétricos con el LFA comercial COVID-19 Ag revelaron un rendimiento de detección más bajo con un LOD más alto. Con BEETLES2, aumentamos el rendimiento de la detección aumentando el LOD hasta 20 veces.

Se utilizaron muestras clínicas (pacientes con COVID-19 (n = 42) y controles sanos (n = 20)), incluidos hisopos NP/OP (n = 30) y muestras de saliva (n = 12), para validar el potencial clínico de BEETLES2 (Fig. .4). Para demostrar claramente la mejora del rendimiento, incluimos muestras con cargas virales intermedias (26 ≤ Ct <30, n = 15: 15/42, 35%) y bajas (Ct ≥ 30, n = 20: 20/42, 48%) donde la sensibilidad de las LFA comerciales cayó abruptamente.

Las muestras clínicas incluyen pacientes con COVID-19 (n = 42) y controles sanos (n = 20). Incluimos muestras de pacientes con baja carga viral (Ct ≥ 30, n = 20: 48%) para observar la mejora en el caso de una carga viral baja. Realizamos la prueba clínica para cada paciente una vez (n = 1). a – f Mejora de la sensibilidad con BEETLES2 utilizando (a) muestras NP/OP, (b) muestras de saliva, (c) variantes Delta, d variantes Omicron, (e) muestras de individuos asintomáticos y (f) controles sanos. g –i La precisión diagnóstica de BEETLES2, incluidas todas las muestras de NP/OP, saliva, asintomáticos y diversas variantes, muestra que la sensibilidad general de BEETLES2 es significativamente mayor (88,1%) (P <0,0001) que aquellos que utilizan LFA comerciales ( 14,29%) (P = 0,0041). Para el análisis se utilizó la prueba t no pareada bilateral y no se realizaron ajustes para comparaciones múltiples. j Reactividad cruzada utilizando diferentes virus respiratorios que no muestran reactividad cruzada. k RT-qPCR con enriquecimiento solo con AAO y BEETLES2, que muestra que BEETLES2 puede mejorar el diagnóstico molecular incluso con VTM. l–n La viabilidad del seguimiento diario de COVID-19 representa la capacidad de realizar pruebas frecuentes con una precisión significativamente mayor. Con BEETLES2, medimos el valor de Ct por encima de 37. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Medio de transporte viral VTM, herramientas de enriquecimiento de bioingeniería BEETLES2 para LFA con sensibilidad y especificidad mejoradas, óxido de aluminio anódico AAO, ensayo de flujo lateral de LFA, NP/OP nasofaríngeo/orofaríngeo.

Según se informa, se debe comprender la precisión de la prueba para diferentes grupos y muestras debido a la heterogeneidad de las pruebas de antígenos y los grupos de población8. Analizamos las variantes más extendidas del SARS-CoV-2, Delta y Omicron. Según se informa, el porcentaje combinado de infecciones asintomáticas fue del 32,40 % para Omicron38. También comprobamos la capacidad de realizar pruebas a personas asintomáticas. La mayoría de las muestras se recogieron en el hospital St. Mary's de Seúl. Recogimos NP/OP clínica en un medio de transporte viral (VTM) y el ensayo se preparó utilizando el protocolo estándar de acuerdo con las pautas del fabricante de LFA. Llamamos al LFA comercial para control sin BEETLES2 y denotamos LFA comercial asistido por BEETLES2 como con BEETLES2. Adquirimos el valor de corte maximizando la suma de la sensibilidad (verdadero positivo) y la especificidad (verdadero negativo) de las pruebas de COVID-19.

Primero, verificamos la mejora de la sensibilidad con BEETLES2 usando muestras NP/OP (Fig. 4a: n = 30). Después de la carga, las muestras de NP/OP se diluyeron con un tampón PBS y se inyectaron en la célula agitada. Luego se aplicó una presión constante (~3 bar) con un regulador. En general, la sensibilidad de los LFA comerciales disminuyó abruptamente los títulos de virus en cargas virales intermedias y bajas (Ct ≥ 26). Con muestras NP/OP, la sensibilidad de los LFA comerciales fue del 10% (3/30 = 10%). Luego se aumentó la sensibilidad con BEETLES2 (27/30 = 90%).

En segundo lugar, validamos la sensibilidad utilizando muestras de saliva (Fig. 4b). Un ensayo que utiliza muestras de saliva tiene ventajas significativas para una recolección de muestras fácil y no invasiva39; sin embargo, los ensayos de saliva necesitan pasos adicionales de recolección de muestras, como la prefiltración. Para la prefiltración de células y desechos, utilizamos una membrana filtrante de 450 nm. Según se informa, las pruebas que utilizan muestras de saliva tienen una mayor sensibilidad de detección en los primeros 10 días después de la infección40. En comparación con la sensibilidad del LFA comercial antes del enriquecimiento (3/12 = 25%), todas las muestras analizadas con BEETLES2 tuvieron una mayor sensibilidad (10/12 = 83,3%), lo que indica una mejora del rendimiento después del enriquecimiento de la muestra. Para el uso práctico de ensayos salivales con BEETLES2, sugerimos un sistema simple de recolección y purificación de saliva (Pure-SAL, Oasis Diagnostics) (Fig. S11a).

En tercer lugar, observamos la sensibilidad utilizando dos variantes (Fig. 4c, d, respectivamente). Generalmente, el LFA de la prueba COVID-19 Ag se dirige a las proteínas N. A diferencia de la RT-qPCR, que depende en gran medida de la variante, como Delta y Omicron41, las proteínas N a las que se dirige la prueba COVID-19 Ag dependen menos de las mutaciones. Tanto para Delta (n = 10, Fig.4c) como para Omicron (n = 32, Fig. 4d), todas las muestras se probaron utilizando BEETLES2 y LFA comercial. En consecuencia, adquirimos mayor sensibilidad para Delta (10/10 = 100%) y Omicron (27/32 = 84,38%) con BEETLES2 que con LFA comercial: 20% (2/10 = 20%) y 12,5% (4/32). = 12,5%) para Delta y Omicron, respectivamente.

Cuarto, consideramos casos asintomáticos (Fig. 4e). La identificación rápida de casos asintomáticos es una estrategia clave para reducir la transmisión futura de los virus COVID-1942. Los verdaderos valores positivos, es decir, la sensibilidad, utilizando BEETLES2 fueron mayores (3/4 = 75%) que los LFA comerciales (controles: 0/4 = 0%). Aclaramos puntos de datos cerca de la línea de corte con los resultados de la prueba LFA (Fig. S12). Aunque el número de muestras asintomáticas no fue suficiente, BEETLES2 podría proporcionar una detección mejor y más temprana de individuos asintomáticos.

Quinto, para verificar la especificidad, probamos las señales colorimétricas de controles sanos (n = 20) que muestran una especificidad del 100% (verdaderos negativos = 20/20) (Fig. 4f). La especificidad se conoce como tasa de verdaderos negativos. Por lo tanto, aumentamos la especificidad al reducir los falsos positivos.

En general, evaluamos la precisión diagnóstica de BEETLES2, considerando todas las muestras de NP/OP, saliva, asintomáticas y diversas variantes (Fig. 4g y h). La Figura 4g muestra el ensayo con BEETLES2 y la Figura 4h muestra el ensayo con LFA comercial. Los valores positivos verdaderos generales, es decir, la sensibilidad, usando BEETLES2 son significativamente más altos (37/42 = 88,1%) que aquellos que usan LFA comercial sin BEETLES2 (6/42 = 14,29%) (Fig. 4i). Nuestro sistema BEETLES2 propuesto cumple con las pautas de 'criterios deseables' de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para POCT (sensibilidad: >90%, especificidad: >99%, Ct ≥ 30 y tiempo de ensayo: <20 min) más allá de los 'criterios aceptables'. (sensibilidad: >80%, especificidad: >97%, 26 ≤ Ct ≤35 y tiempo de ensayo: <40 min)43.

Otro parámetro importante para el diagnóstico de COVID-19 es la reactividad cruzada (Fig. 4j). Evaluamos la reactividad cruzada utilizando diferentes virus respiratorios como el virus respiratorio sincitial A (RSV A), RSV B, Influenza A (H1N1), Influenza B y coronavirus humano-OC43 (HCoV-OC43) (n = 3 para cada muestra). y no se observó reactividad cruzada.

Tanto la prueba LFA como el enriquecimiento de BEETLES2 podrían contribuir a la reactividad cruzada y la especificidad. Sin embargo, dado que el fabricante de LFA controló estrictamente la reactividad cruzada y la especificidad (>99%), esperamos que los resultados de la reactividad cruzada y la especificidad se deban principalmente al enriquecimiento de BEETLES2 (Tabla S1). No observamos problemas de reactividad cruzada ni de especificidad para otros virus, lo que demuestra un alto potencial para cumplir con los criterios de la OMS.

Se ha utilizado una membrana AAO para desarrollar un inmunoensayo para la detección del SARS-CoV-2 en saliva mediante el enriquecimiento de los virus del SARS-CoV-29. Después de ese estudio, preparamos solo una membrana AAO y observamos la purificación y el enriquecimiento del virus mediante RT-qPCR (Fig. 4k). En los tampones PBS, los virus intactos podrían enriquecerse a través de la membrana AAO, como se presenta. Sin embargo, no pudimos enriquecer partículas de virus usando la membrana AAO en un tampón de lisado (VTM) debido a la falta de virus lisados ​​de VTM para el enriquecimiento. Por lo tanto, el valor de Ct utilizando la membrana AAO no cambió significativamente. En muchos casos clínicos reales, las muestras se entregan con lisado inactivado (es decir, VTM). El valor de Ct se mejoró con BEETLES2, incluso con VTM, hasta 5,1, lo que teóricamente corresponde a 34,3 concentraciones de enriquecimiento.

Para lograr la viabilidad del monitoreo diario de COVID-19, recolectamos muestras diarias de NP/OP y saliva de personas infectadas con síntomas (Fig. 4l-m). El día de aparición (día 0) se definió como el primer día de síntomas. Todos los pacientes dieron positivo en RT-qPCR el primer día de síntomas. Adquirimos datos diarios mediante RT-qPCR y LFA con enriquecimiento de BEETLES2. Como la RT-qPCR puede detectar la diseminación viral mucho después del período infeccioso (~9 días), el resultado positivo de la RT-qPCR podría incluir una cuarentena innecesaria. Por el contrario, las pruebas frecuentes de LFA de alta sensibilidad (2 a 3 pruebas diarias) pueden proporcionar cambios en la señal de encendido/apagado, incluso en los datos cuantitativos. Los datos de seguimiento diario revelaron que el ensayo LFA con BEETLES2 está altamente correlacionado con la carga viral (valor Ct), lo que representa que nuestra técnica evalúa pruebas frecuentes con una precisión significativamente mayor que el LFA comercial y la RT-qPCR. Con BEETLES2, pudimos medir el valor de Ct por encima de 37, que el LFA comercial no pudo detectar (Fig. 4n).

En comparación con otras técnicas de enriquecimiento y aislamiento de virus existentes, nuestro BEETLES2 tiene ventajas en cuanto a permselectividad, capacidad de ajuste, potente capacidad de enriquecimiento tanto para virus intactos como para sus proteínas N, y aplicabilidad como dispositivo portátil (consulte la Tabla S2 para comparar diferentes técnicas de aislamiento de virus y enfoque de enriquecimiento). Para comercializar BEETLES2, debemos abordar las siguientes cuestiones: 1) diseño soportable a la presión. Dado que el ensayo BEETLES2 se realiza bajo presión aplicada, no se puede tolerar ninguna fuga de muestra líquida. Especialmente cuando se manipulan muestras infecciosas, se necesita un diseño sin fugas por motivos de seguridad. 2) La cuestión del volumen en las pruebas serológicas de diagnóstico rápido. Para las pruebas serológicas de diagnóstico rápido, normalmente se obtienen 1 o 2 gotas (<100 µL) mediante un pinchazo en el dedo; por lo tanto, necesitamos desarrollar dispositivos para análisis de sangre con pequeños volúmenes de muestra. Un dispositivo de microfluidos integrado con la membrana BEETLES2 es un candidato ideal para ensayos serológicos. 3) La vida útil es un parámetro clave para comercializar BEETLES2. Obtuvimos estabilidad, hasta por 15 días, a temperatura ambiente. Sin embargo, la vida útil esperada se puede extender aún más con pruebas adicionales (Fig. S13).

En conclusión, la preparación de muestras de BEETLES2 con su potente permselectividad y capacidad de ajuste proporciona una respuesta binaria más sensible que el LFA comercial en 3 minutos. Tiene dos ventajas prácticas importantes: en primer lugar, el sistema se puede acoplar fácilmente con LFA comerciales bien establecidos y aumentar su sensibilidad clínica (>88%) y precisión (>91%) para muestras clínicas de títulos bajos, incluidas las variantes Delta y Omicron, en comparación. con las AGL comerciales (14,29% y 41,94%, respectivamente). En segundo lugar, BEETLES2 puede enriquecer selectivamente el virus SARS-CoV-2, las proteínas N y la IgG del hisopo nasal, la saliva y el suero sanguíneo, lo que demuestra su versatilidad y aplicabilidad a las pruebas de Ag e IgG de COVID-19.

La combinación del enriquecimiento de muestras de BEETLES2 con LFA comercial representa un avance en la detección POCT ya que cumple con todos los requisitos establecidos por la OMS para POCT, es decir, facilidad de uso, bajo costo y precisión44. Esperamos que BEETLES2 se comercialice a un costo adicional nominal, cumpliendo así con los criterios de bajo costo. Además, la combinación de aplicaciones de teléfonos inteligentes asistidas por IA con BEETLES2 podría predecir con precisión el encendido/apagado y realizar una clasificación cuantitativa, lo que demuestra un gran potencial para REASURED (conectividad en tiempo real, facilidad de recolección de muestras, asequible, sensible, específico, fácil de usar, Rapid, Equipment free and Delivered)45, un nuevo criterio para la conectividad digital, y posiblemente detectar la transmisión asintomática con estrategias simples de prueba frecuentes8,42, lo cual es difícil con las pruebas RT-qPCR.

Se recogieron muestras respiratorias de forma prospectiva de pacientes diagnosticados con infección por COVID-19 en el Hospital St. Mary's de Seúl desde abril de 2021 hasta mayo de 2022. Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional (KC21TIDI0134K) del Hospital St. Mary's de Seúl y se obtuvo el consentimiento informado. de los participantes.

Extrajimos RBCM de sangre entera humana anticoagulada con K2EDTA y eliminamos el plasma y la capa leucocitaria utilizando una centrífuga de 800 g durante 5 minutos para aislar los glóbulos rojos. Después de retirar el sobrenadante, lavamos los glóbulos rojos restantes tres veces con 1 × PBS helado con un suave apretón de manos. A continuación, hemolizamos los glóbulos rojos suspendiéndolos en PBS 0,25 × helado durante 30 minutos. Finalmente, eliminamos la hemoglobina libre mediante una centrífuga de 20.000 g durante 30 min. Después de tres lavados, se obtuvo un gránulo de RBCM de color rosa claro y se almacenó a -80 °C para uso futuro. Los RBCM extraídos tenían la forma de un liposoma cargado negativamente de 200 nm de tamaño (Fig. S2). La solución sonicada se dejó caer sobre la membrana AAO (6809-6002, Whatman, Reino Unido) y se incubó durante 30 minutos a 50 °C para formar múltiples bicapas lipídicas soportadas. Para investigar la microestructura de la membrana de BEETLES2, realizamos análisis estructurales mediante SEM, AFM y microscopía fluorescente.

Se tomaron muestras de membranas AAO-RBCM para obtener imágenes KPFM en una oblea de silicio tipo p (ePAK International, EE. UU.), un sustrato con conductividad eléctrica. Las obleas de silicio se sumergieron en solución de piraña (H2O2 y H2SO4) durante 15 minutos, se lavaron con agua destilada y se secaron con gas N2 (Sejong Industrial Gas Co., Corea). Se utilizó un microscopio de fuerza atómica MultiMode VIII para analizar las membranas AAO-RBCM eléctrica y topológicamente en modo KPFM de amplitud modulada (Bruker, EE. UU.). Las mediciones de KPFM se realizaron a 23 °C en aire utilizando el modo de escaneo de elevación basado en el modo de golpeteo. Se utilizaron puntas conductoras de AFM recubiertas con Pt (SCM-PIT-V2; Bruker, EE. UU.) para analizar las propiedades nanoeléctricas de las muestras. Se capturó una imagen topológica de AFM en el primer escaneo usando el modo de golpeteo con un sesgo de punta cero. Para detectar los potenciales de superficie, la punta del AFM se levantó 20 nm por encima de la superficie de la muestra con un voltaje de polarización de muestra aplicado durante el escaneo entrelazado. El accionamiento mecánico del voladizo se apagó durante el escaneo entrelazado y se aplicó un voltaje de polarización de corriente alterna (CA) a 1000 mV a la sonda en la resonancia mecánica (ω) del voladizo. El VAC hace que el voladizo oscile debido a interacciones electrostáticas atractivas y repulsivas (Fes) entre la sonda y la muestra, definidas de la siguiente manera:

donde VDC es el voltaje de polarización de corriente continua (DC) y VCPD es la diferencia de potencial de contacto entre la sonda y la muestra.

La aplicación de un VCC de compensación a la sonda para eliminar las fuerzas electrostáticas (es decir, Fes) entre la sonda y la muestra establece un circuito de retroalimentación proporcional-integral-derivada que monitorea y controla la amplitud de las oscilaciones en voladizo. Estos dependen de la capacitancia C y la altura z de la sonda y la muestra. La velocidad de exploración de KPFM fue de 0,6 Hz, el tamaño de exploración y el punto de ajuste de amplitud a 12 nm fueron de 4 μm × 4 μm a 512 × 512 píxeles, respectivamente. Se utilizó el software MountainsSPIP para nivelar, procesar y analizar las imágenes AFM (versión 9; Digital Surf, Francia). Además, utilizando Gwyddion se realizaron estudios de rugosidad superficial (versión 2.60).

Se utilizó FRAP para validar la formación SLB de RBCM para evaluar su fluidez y difusividad. En todos los experimentos, se intercaló 1% en peso de PE-CF en RBCM como sonda fluorescente. Blanqueamos un punto de 20 μm de diámetro en el plano z de las capas de RBCM mediante un láser semiconductor bombeado ópticamente de 488 nm (Coherent, Inc.) a 150 mW durante 5 s. La recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo en el punto deseado se controló durante 5 minutos mediante un microscopio confocal Zeiss LSM-800. Cada punto de referencia de la imagen sirvió como estándar para medir y normalizar la intensidad de la fluorescencia del punto. Soumpasis et al.26 informaron sobre la intensidad de fluorescencia normalizada frente al tiempo ajustada con una función de Bessel. A continuación, se calculó el coeficiente de difusión (D) del tinte en cada composición de SLB utilizando la siguiente expresión: D = w2/4t1/2, donde w es el radio de la mancha fotoblanqueada y t1/2 es el tiempo necesario para alcanzar la mitad. de la máxima recuperación de la intensidad de fluorescencia.

Utilizamos kits rápidos comerciales para COVID-19 Ag (Calth Inc., República de Corea) y probamos el rendimiento mejorado mediante BEETLES2. Preparamos un antígeno recombinante de proteína N de COVID-19 (45 kDa, FPZ0516, Fapon Biotech Inc., China), considerado el mejor objetivo de prueba de Ag de COVID-19, utilizando tampones 1×PBS (LB004, DUKSAN, República de Corea) para probar. sensibilidad y LOD. La albúmina sérica bovina (BSA) (A7030, Sigma-Aldrich, EE. UU.), la IgG humana (I4506, Sigma-Aldrich, EE. UU.) y los fragmentos Fc de IgG humana (401104, Sigma-Aldrich, EE. UU.) se adquirieron de Sigma-Aldrich. Posteriormente, preparamos siete concentraciones de la muestra de proteína N de COVID-19 con 1xPBS. Agregamos ~ 3 ml de cada muestra en una celda agitada de policarbonato (341000, STERLITECH, EE. UU.) y operamos durante 3 minutos. A continuación, se recuperaron con una pipeta los 100 μL de la muestra enriquecida. Se utilizaron espectrofotómetros NanoDrop (Thermo Scientific, EE. UU.) y SDS-PAGE (KOMA precast gel tipo BC, Koma Biotech, República de Corea) para analizar y cuantificar proteínas.

Para la prueba COVID-19 Ab (Fig. 3i), preparamos siete concentraciones de la muestra de anticuerpos COVID-19 (plasma de citrato de sodio, Trina Bioreactives AG, Suiza) con 1xPBS. Agregamos 3 ml de cada muestra a una celda agitada de policarbonato (341000, STERLITECH, EE. UU.) montada con una membrana AAO recubierta con RBCM y la operamos durante 3 minutos. A continuación, la muestra enriquecida se recuperó mediante una pipeta con 100 μl de tampón de extracción LFA. Posteriormente, utilizamos la muestra enriquecida en el kit COVID-19 Ab LFA (AllCheck COVID-19 IgG/IgM, Calth Inc., Corea) y anotamos el resultado a los 10 minutos.

De manera similar, para la prueba salival de COVID-19 Ag (Fig. 3j), diluimos siete concentraciones de la muestra de proteína N de COVID-19 con saliva artificial (A7990, Solarbio, China). Primero, agregamos 3 ml de cada muestra a una celda agitada de policarbonato montada con una membrana AAO recubierta con RBCM y la operamos durante 3 minutos. A continuación, la muestra enriquecida se recuperó mediante una pipeta con 100 µl de tampón de extracción LFA. Posteriormente, utilizamos la muestra enriquecida en el kit COVID-19 Ag LFA y anotamos el resultado a los 10 min.

Analizamos las intensidades de color del kit LFA comercial y del LFA asistido por BEETLES2 utilizando un sistema óptico controlado por National Instrument (NI) hecho a medida junto con LabVIEW v 2019 SP1 (National Instruments Co., EE. UU.). Para establecer el LOD (Fig. 3) y los valores de corte (Fig. 4), primero medimos las señales de color utilizando el lector comercializado y un sistema óptico controlado por NI personalizado con LabVIEW. A continuación, cinco ingenieros capacitados individualmente (Calth Inc. http://www.thecalth.com) observaron la señal colorimétrica utilizando la tabla de colores estándar y las pautas del fabricante para determinar el LOD. Mientras tanto, establecimos los valores de corte para minimizar los falsos positivos para adquirir una mayor especificidad según las pautas del fabricante.

Recolectamos muestras clínicas de NP/OP y saliva de pacientes con COVID-19 en el hospital St. Mary's de Seúl con la aprobación apropiada del Comité de la Junta de Revisión Institucional (KC21TIDI0134K). Aunque los hisopos NP/OP estaban contenidos en el medio de transporte viral (VTM), las muestras de saliva se recogieron en un tubo esterilizado y se diluyeron con PBS.

Para probar el rendimiento en objetivos con bajo contenido viral, para una carga viral alta (Ct <26), agregamos muestras de NP/OP a tampones PBS y las preparamos como muestras con bajo contenido viral. Para muestras de saliva con una carga viral alta, agregamos tampón PBS a las muestras. Finalmente, preparamos muestras con bajo contenido viral con Ct ≥ 30. Para controles sanos, recolectamos (o compramos) muestras de voluntarios sanos y las almacenamos a -20 °C. Los resultados obtenidos se compararon con las pruebas RT-qPCR SARS-CoV-2 utilizando el kit ID2 de variantes del SARS-CoV-2 AccuPower® (BIONEER, República de Corea), según el protocolo del fabricante. El valor de corte para el diagnóstico in situ de COVID-19 se adquirió maximizando la suma de la sensibilidad (verdadero positivo) y la especificidad (verdadero negativo) de las pruebas de COVID-19.

Para realizar el prototipo para la preparación de muestras POCT, fabricamos un dispositivo portátil de mano integrado con la membrana BEETLES2 (ver Fig. S11). Diseñamos dos reservorios: reservorios de muestra y reservorios de amortiguación en funcionamiento disponibles comercialmente. Para el prototipo se utilizó microfresado. Calculamos la presión manual promedio de cinco personas (4 hombres y 1 mujer) con BEETLES2 como 2,3 ± 0,2 bar (Fig. S14). Demostramos que la permselectividad de las proteínas BSA y N se mantenía bajo presión manual. Las jeringas portátiles accionadas manualmente son alternativas de bajo costo para el diagnóstico en el lugar de atención, que pueden aplicarse directamente a los LFA comerciales. Primero conectamos la membrana BEETLES2 al depósito de muestra y empujamos el émbolo para el enriquecimiento. Después de 3 minutos de operación, invertimos la dirección de unión de la membrana BEETLES2 al depósito de amortiguación en funcionamiento. Dado que el tampón de funcionamiento comercial incluía un tensioactivo, pudimos demostrar con éxito el ensayo de proteína N independientemente de la fuerza electrostática entre la proteína N y la capa de RBCM. Posteriormente, realizamos ensayos utilizando LFA comercial siguiendo las pautas del fabricante. Con más investigación, estamos desarrollando un segundo prototipo simplificado en el que se utiliza una cámara de vacío para aplicar presión.

Las barras de error presentadas en las figuras representan la media ± DE. Repetimos todos los experimentos al menos tres veces por punto y analizamos los datos utilizando Microsoft Exel, Prism v 7.0. Para los análisis gráficos se utilizaron los software Biorender, 3D MAX v 2020, V-Ray v 4.0, Adobe Photoshop v 2020 y Adobe Illustrator v 2020. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. Para determinar la importancia de la validación clínica, analizamos sus datos con una prueba t no pareada bilateral para examinar las diferencias entre los grupos. Un valor de AP inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Desarrollo de Tecnología Médica y Bio de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (No. 2021M3E5E3080743).

Estos autores contribuyeron igualmente: Seong Jun Park, Seungmin Lee, Dongtak Lee.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Dae Sung Yoon, Yong Kyoung Yoo, Jeong Hoon Lee.

Departamento de Ingeniería Eléctrica, Universidad de Kwangwoon, 20 Kwangwoon-ro, Nowon, Seúl, 01897, República de Corea

Seong Jun Park, Seungmin Lee, Na Eun Lee, Jeong Soo Park, Ji Hye Hong y Jeong Hoon Lee

Escuela de Ingeniería Biomédica, Universidad de Corea, 145 Anam-ro, Seongbuk, Seúl, 02841, República de Corea

Seungmin Lee, Dongtak Lee, Ji Hye Hong, Jae Won Jang, Hyunji Kim y Dae Sung Yoon

Departamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad de Corea, Seúl, 02841, República de Corea

Por Eun Lee

Programa Interdisciplinario en Salud Pública de Precisión, Universidad de Corea, Seúl, 02841, República de Corea

Jae Won Jang, Hyunji Kim y Dae Sung Yoon

Departamento de Biotecnología y Bioinformática, Universidad de Corea, Sejong, 30019, República de Corea

Seokbeom Roh y Gyudo Lee

Programa de Posgrado Interdisciplinario en Tecnología de Convergencia Inteligente de Inteligencia Artificial, Universidad de Corea, Sejong, 30019, Corea

Seokbeom Roh y Gyudo Lee

CALTH Inc., Changeop-ro 54, Seongnam, Gyeonggi, 13449, República de Corea

Dongho Lee

Instituto de Investigación Biológica de Vacunas, Facultad de Medicina, Universidad Católica de Corea, Seúl, República de Corea

Sung Yeon Cho, Chulmin Park, Dong Gun Lee, Raeseok Lee y Dukhee Nho

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad Católica de Corea, Seúl, República de Corea

Sung Yeon Cho, Dong Gun Lee, Raeseok Lee y Dukhee Nho

Astrion Inc., Seúl, 02841, República de Corea

Dae Sung Yoon

Departamento de Ingeniería Electrónica, Universidad Católica de Kwandong, 24, Beomil-ro 579 beon-gil, Gangneung-si, Gangwon-do, 25601, República de Corea

Yong Kyoung Yoo

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SJP, SL, DL (Dongtak Lee), DSY, YKY y JHL concibieron y diseñaron el estudio. NEL, JSP y JHH realizaron los experimentos de PCR. DL (Dongtak Lee), JWJ y HK realizaron la extracción de la membrana de los glóbulos rojos y la caracterización del material. SR y GL realizaron una caracterización de materiales basada en microscopía de fuerza con sonda Kelvin. DL (Dongho Lee), SC, CP, DL (Dong-Gun Lee), RL y DN proporcionaron muestras clínicas e interpretaron los resultados. SJP, SL, DL (Dongtak Lee), YKY y JHL redactaron el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Dae Sung Yoon, Yong Kyoung Yoo o Jeong Hoon Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Olivier Vandenberg y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Park, SJ, Lee, S., Lee, D. et al. Rendimiento similar a la PCR de una prueba rápida con nanotrampa sintonizable permselectiva. Nat Comuna 14, 1520 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37018-6

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Recibido: 03 de octubre de 2022

Aceptado: 24 de febrero de 2023

Publicado: 18 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37018-6

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