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Jun 10, 2024

Una nueva estrategia para detectar mutaciones en el voltaje.

Enfermedades Infecciosas de la Pobreza volumen 12, Número de artículo: 74 (2023) Citar este artículo 231 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics La estrategia actual de prevención y control de Aedes albopictus en gran medida

Enfermedades infecciosas de la pobreza volumen 12, número de artículo: 74 (2023) Citar este artículo

231 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

La estrategia actual de prevención y control de Aedes albopictus depende en gran medida de una gestión integral, como la gestión ambiental y el control químico. Sin embargo, la amplia aplicación de piretroides ha facilitado el desarrollo de resistencia a los insecticidas, principalmente a través de mutaciones en el gen del canal de sodio dependiente de voltaje (VGSC). Este estudio tiene como objetivo desarrollar una estrategia novedosa para detectar mutaciones en el gen VGSC en Ae. albopictus utilizando tecnología de minisecuenciación por espectrometría de masas y PCR múltiple (MPCR-MS).

Establecimos una nueva estrategia para detectar mutaciones en el gen VGSC en Ae. albopictus utilizando tecnología de minisecuenciación MPCR-MS. Se utilizaron por primera vez la amplificación MPCR y la extensión de sonda de masa (MPE), seguidas de la espectrometría de masas de tipificación del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), que permite la detección simultánea de múltiples sitios de mutación del gen VGSC en 96 muestras de Ae. albopictus. Un total de 70 Ae. albopictus se utilizaron para evaluar el desempeño del método comparándolo con otros métodos.

Se pueden detectar simultáneamente tres sitios objetivo (1016, 1532, 1534) en el gen VGSC mediante amplificación por PCR doble combinada con espectrometría de masas de tiempo de vuelo, ionización y desorción láser asistida por matriz, logrando un límite de detección de 20 fg/μl. Aplicamos este método a 70 Ae. albopictus y los genotipos obtenidos fueron consistentes con los resultados de la secuenciación de rutina, lo que sugiere la precisión de nuestro método.

La tecnología de minisecuenciación MPCR-MS proporciona un enfoque sensible y de alto rendimiento para Ae. Detección de mutaciones del gen albopictus VGSC. En comparación con la secuenciación convencional, este método es económico y ahorra tiempo. Es de gran valor para la vigilancia de la resistencia a los insecticidas en zonas con alto riesgo de enfermedades transmitidas por vectores.

Aedes albopictus es un vector importante para la transmisión de arbovirus, incluidos el virus del dengue, el virus chikungunya y el virus Zika [1,2,3]. Como una de las especies de mosquitos más invasoras con una reproducción rápida y un comportamiento agresivo [4, 5], Ae. albopictus ha expandido con éxito su presencia en más de 70 países en todo el mundo [6]. Actualmente, Ae. albopictus se controla mediante una combinación de métodos biológicos, químicos y físicos, y los insecticidas químicos se utilizan principalmente para matar mosquitos directamente [7, 8]. De estos insecticidas, los piretroides son los más utilizados debido a su amplio espectro, alta eficiencia y baja toxicidad para los mamíferos [9, 10].

Los canales de sodio dependientes de voltaje, codificados por el gen VGSC, son el principal objetivo de los insecticidas piretroides. Mutaciones en el gen VGSC podrían reducir la susceptibilidad de Ae. albopictus a los piretroides, lo que resulta en resistencia a la caída [11]. La primera mutación sensorial (F1534C) se descubrió en Singapur en 2011 [12]. La secuencia de los loci del gen VGSC en Ae. albopictus se determina en función de la numeración de los canales de sodio en Musca domestica [13]. Se han encontrado múltiples sitios de mutación en el gen VGSC en Ae. Albopictus [14,15,16,17,18,19,20], y se ha confirmado que tres de ellos (1016, 1532 y 1534) están asociados con la resistencia al derribo [11]. La mutación de GTA a GGA en el sitio del codón 1016 da como resultado un cambio de aminoácido de valina (V) a glicina (G) [21]. En el locus 1532, ATC (isoleucina, I) puede mutarse a ATA (isoleucina, I) o ACC (treonina, T) [14]. En el locus 1534, el TTC (fenilalanina, F) de tipo salvaje puede mutarse de forma sinónima a TTT (fenilalanina, F) o mutarse de forma no sinónima a TCC/TCG (serina, S), TGC (cisteína, C), TTG/CTG/CTC. /TTA (leucina, L), CGC (arginina, R) o TGG (triptófano, W) [12, 16, 18,19,20].

Actualmente, la detección de mutaciones en el gen VGSC en Ae. albopictus se basa en la secuenciación del ADN o en la PCR específica de alelo (AS-PCR). La secuenciación de ADN es la más utilizada y se considera el estándar de oro para detectar mutaciones en VGSC. Sin embargo, la tecnología de secuenciación de ADN no es adecuada para estudios con un número sustancial de muestras debido a su alto costo y requisitos de tiempo [19]. AS-PCR [19] también se ha utilizado para detectar mutaciones en VGSC en Ae. albopictus pero sólo es adecuado para la detección en un solo sitio, con una especificidad relativamente baja. Por lo tanto, se busca un método de detección rápido, preciso, económico y multisitio para mutaciones de VGSC en Ae. albopictus es una necesidad urgente.

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo, ionización y desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) se utiliza a menudo para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). El proceso principal de este método es extraer ADN de Ae. albopictus y amplificar genes que contienen objetivos de SNP mediante reacción en cadena de la polimerasa múltiple (MPCR). Luego, la sonda de masa se diseña para ampliar los sitios de SNP detectados. Finalmente, la relación masa-carga (m/z) de la base extendida identificada por MALDI-TOF MS se utiliza para determinar el tipo de base del sitio. Este método también se denomina tecnología de minisecuenciación MPCR-MS [22]. En la actualidad, se utiliza ampliamente en la clínica (por ejemplo, pruebas y análisis microbiológicos) [23] y es muy prometedor para el análisis de SNP porque puede detectar rápida y simultáneamente múltiples objetivos [22, 24].

En este estudio, se utilizó la tecnología de minisecuenciación MPCR-MS para detectar 17 genotipos simultáneamente en tres sitios de mutación del gen VGSC en Ae. albopictus. Se utilizó el método establecido de tecnología de minisecuenciación MPCR-MS para detectar el gen VGSC en 70 muestras de Ae. albopictus capturados en campo y se evaluó la confiabilidad del método.

Un total de 13 Ae. Se utilizaron muestras de albopictus para establecer el método de tecnología de minisecuenciación MPCR-MS. Se obtuvieron muestras de BJ1 del Instituto Nacional para el Control y la Prevención de Enfermedades Infecciosas, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades, en 2021. BJ1, la población de tipo salvaje susceptible a los piretroides, sirvió como mosquitos de control en este estudio (BJ1: V/ V, I/I, F/F). Las poblaciones de mosquitos de tipo mutado o resistentes se recolectaron en siete ciudades (distritos) de seis provincias de China en 2020: YB2, MS32, LC1, LC7, MS5, YB8, HK33, LY6, SZ48, JN17, LY55 e YB6.

Se utilizaron otras 70 muestras recolectadas de forma silvestre con un estado de mutación desconocido en el gen VGSC, números de muestra de HNLY1-HNLY30 y HNXC1-HNXC40, para probar el rendimiento del método de tecnología de minisecuenciación MPCR-MS recientemente establecido. La información sobre la recopilación de muestras se proporciona en la Tabla 1.

El ADN se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN genómico de microtejidos con perlas magnéticas (Bioteke Corporation, Wuxi, China). Los tres sitios de mutación de VGSC estudiados (1016, 1532, 1534) se secuenciaron de acuerdo con artículos publicados [12, 21]. Se utilizaron un total de 13 muestras para establecer el método de tecnología de minisecuenciación MPCR-MS para la detección de 14 genotipos de mutación (V/G, G/G, I/T, T/T, F/S, S/S, F/ C, C/C, F/L, L/L, S/C), como se muestra en la Tabla 2. Las 70 muestras recolectadas de forma silvestre se utilizaron para la validación del método y se utilizó una secuenciación de rutina para detectar genes VGSC en las muestras. Un archivo adicional muestra esto con más detalle (ver archivo adicional 1).

Se utilizó el software Primer Premier (http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/) para el diseño del cebador. Se diseñaron dos conjuntos de cebadores de PCR para amplificar los tres sitios objetivo de VGSC para PCR múltiple (Tabla 3). Las longitudes de los cebadores oscilaron entre 18 y 22 pb, con una secuencia fija de 10 pb (ACGTTGGATG) añadida al extremo 5' de cada cebador.

Las sondas de diferencia de calidad MALDI-TOF MS para sitios de mutación se diseñaron utilizando el software de análisis de locus genético IntelliBio (V2.0, IntelliBio, Qingdao, China) (Tabla 4). La longitud de la sonda de masa estaba entre 17 y 28 pb. El peso molecular se diseñó para que fuera de 4 a 9 kDa con una diferencia mínima de 16 Da entre estas sondas. Las sondas vg1016, fl15341, sc1534 y fl15342 se pueden extender en un tubo de reacción (indicado como tubo A), y las sondas it1532, fl15341-2 y sc1534-2 se pueden extender en otro tubo de reacción (indicado como tubo B).

En Ae. albopictus, el método de análisis se desarrolló utilizando los genes VGSC de tipo salvaje y mutados como plantillas. El tampón completo sin ADN molde sirvió como control en blanco (se usó agua libre de ácido nucleico en lugar de ADN molde). El procedimiento operativo incluyó principalmente extracción de ADN, amplificación por PCR múltiple, extensión de sonda masiva (MPE), adquisición de datos MALDI-TOF MS y análisis QuanSNP. Se recopiló el resultado de la detección de cada sonda, se determinó el genotipo en cada sitio y luego se pudo determinar la mutación del locus del gen VGSC (Fig. 1).

Flujo de trabajo de la tecnología de minisecuenciación MPCR-MS para la detección de mutaciones VGSC de Aedes albopictus. MALDI–TOF Ionización por desorción láser asistida por matriz–tiempo de vuelo, SNP Polimorfismo de un solo nucleótido, VGSC Canal de sodio dependiente de voltaje

Se extrajo ADN de todos los tejidos de Ae. albopictus utilizando un kit de extracción de ADN del genoma de microcélulas/tejidos con cuentas magnéticas de 96 pocillos (Bio Teke, Wuxi, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se almacenó a -20 °C.

El MPCR puede amplificar simultáneamente dos fragmentos de ADN, con 1016 sitios ubicados en un segmento de ADN. Los sitios 1532 y 1534 estaban ubicados en otra secuencia de ADN. El instrumento MPCR era el mismo que el instrumento de PCR de secuenciación ordinaria. El MPCR era un sistema de reacción de 10 µl, que incluía 2 × EasyTaqPCR Super Mix de 5 µl, cebadores (1016-F, 1016-R, 3234-F, 3234-R) a 10 µmol/l cada 0,5 µl, plantilla de ADN de 2 µl, y ddH2O 1 µl. Las condiciones de reacción fueron 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 55 °C por 30 s y 72 °C por 30 s; 72ºC durante 8 min; y almacenamiento a 4°C.

La digestión con fosfatasa alcalina (SAP) de camarón se realizó después de múltiples PCR para eliminar los nucleósidos trifosfato desoxigenados (dNTP) libres. El sistema de reacción incluyó 5 µl de productos de PCR y 2 µl de mezcla de SAP (1,53 µl de ddH2O, 0,17 µl de tampón SAP, 0,3 µl de enzima SAP); las condiciones de reacción fueron 37 °C durante 40 min, 85 °C durante 5 min y almacenamiento a 4 °C.

MPE se realizó mediante extensión de base única de productos SAP y sondas de masa mixta. El sistema de reacción incluyó 7 µl de productos de digestión de SAP y 4 µl de mezcla de sonda de masa (1 µl de E-ddNTPmix, 1,4 µl de tampón de masa, 0,6 µl de enzima de masa, 1 µl de sonda de masa). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95 °C durante 30 s, seguido de 52 °C durante 5 s, 80 °C durante 5 s y 5 ciclos, y luego todo el proceso se repitió durante 40 ciclos antes de 72 °C durante 3 min y finalmente se almacenó a 4 °C.

Se añadió una cantidad adecuada de resina al producto MPE para su desalinización y purificación. Primero, se agregaron 14 μl de agua desionizada a cada pocillo de reacción y luego se agregó la resina, seguido de una centrifugación a 1006,2 x g durante 1 min para evitar que la resina se adhiera a la pared del tubo. La placa de muestra se mezcló con resina en un mezclador giratorio a 10,1 x g durante 30 min. Después de mezclar, la muestra se centrifugó a 1006,2 x g durante 1 min y se analizó el sobrenadante.

Finalmente, los productos MPE fueron detectados por MALDI-TOF MS. Se retiraron la placa objetivo OligoPlate y la solución de matriz (ácido 3-hidroxipiridin-2-carboxílico: 3-HPA), la solución de matriz se mezcló completamente antes de su uso, preferiblemente se sonicó durante 2 minutos, y se preparó una mezcla de matriz y sobrenadante de muestra en una proporción de volumen de 1:1. Se dejó caer 3-HPA (1 µl) en el centro del objetivo de muestra. Luego, se mezcló 1 µl de sobrenadante purificado con 1 µl de 3-HPA. Se añadió una mezcla de 1 µl a la placa objetivo del sustrato y se dejó secar. Luego, la muestra cristalizada se analizó utilizando MALDI-TOF MS. Se analizó la relación entre la masa de iones cargados y su carga (m/z) para distinguir entre diferentes sondas y extensiones de sonda en la sustancia probada, y luego se determinó la base en la posición de extensión. Los resultados de la detección de los sitios se exportaron como una tabla de Excel.

Se pueden encontrar detalles en nuestros estudios previos sobre la detección de COVID-19 y Mycoplasma pneumoniae [22, 24].

El plásmido de ADN sin mutaciones en el gen VGSC fue sintetizado y utilizado para determinar el límite de detección más bajo (LDL) de este método. El plásmido de ADN fue sintetizado por Sangon Biotech (Shanghai, China) y el portador fue pUC57. Los cebadores identificados en este estudio se utilizaron para la síntesis genética de las secuencias amplificadas, incluidos tres sitios de mutación del gen VGSC, y se sintetizó un total de 4 μg de plásmido en polvo seco. La concentración original de ácido nucleico se cuantificó y diluyó a lo largo de un gradiente de seis concentraciones (2 pg/μl, 200 fg/μl, 20 fg/μl, 2 fg/μl, 200 ag/μl, 20 ag/μl), y otros Las condiciones de reacción permanecieron sin cambios.

El método establecido de tecnología de minisecuenciación MPCR-MS y el método de secuenciación convencional se probaron en 70 Ae silvestres. albopictus recolectado en la provincia de Henan, China.

Se utilizó Excel 2021 (Microsoft, Washington, EE. UU.) para realizar el análisis estadístico. Los resultados de la detección de muestras se obtuvieron de MALDI-TOF MS en formato Excel (Intelligene Biosystems, IntelliBio, Qingdao, China) y luego se realizó un análisis estadístico descriptivo.

Los tres sitios objetivo de VGSC (1016, 1532 y 1534) se amplificaron mediante PCR doble. Los picos m/z originales de las siete sondas de masa utilizadas (vg1016, it1532, fl15341, fl15341-2, sc1534, sc1534-2, fl15342) fueron 5924,8 ± 3,0, 5102,4 ± 3,0, 7162,6 ± 3,0, 6313,2 ± 3,0, 652 0,2 ​​± 3,0, 7210,8 ± 3,0 y 5253,4 ± 3,0, respectivamente (error de masa inferior a 500 mg/L, lo mismo a continuación; consulte el archivo adicional 2a). Los picos m/z de las siete sondas utilizadas en la extensión de sonda de masa (MPE) fueron 6221,8 ± 3,0, 6197,8 ± 3,0, 5444,4 ± 3,0, 5375,4 ± 3,0, 7459,6 ± 3,0, 7475,6 ± 3,0, 6655,2 ± 3,0, 6586,2 ± 3. .0, 6817,2 ± 3,0, 6833,2 ± 3,0, 6793,2 ± 3,0, 7552,8 ± 3,0, 7483,8 ± 3,0, 7523,8 ± 3,0, 5566,4 ± 3,0, 5526,4 ± 3,0, 5595,4 ± 3,0 y 5550 .4 ± 3.0, respectivamente, y las bases extendidas fueron T, G , T, C, T, C, T, C, T, C, G, T, C, G, C, G, A y T (ver archivo adicional 2b). Para el control en blanco sin plantilla de ADN, los picos en la extensión de la sonda de masa se dan en el archivo adicional 2. c. Un archivo adicional muestra esto con más detalle [ver archivo adicional 2].

Para una mejor ilustración del archivo adicional 2, se brinda una explicación detallada utilizando la muestra YB2 como ejemplo, como se muestra en la Fig. 2. Para el sitio 1016, el genotipo homocigoto de tipo salvaje es GTA/GTA, donde la segunda base T puede ser mutó en G. La detección de la sonda vg1016 reveló dos picos, correspondientes a T y G, respectivamente, lo que sugiere un heterocigoto GTA/GGA de tipo salvaje/mutante. Para el sitio 1532, el genotipo homocigoto de tipo salvaje es ATC/ATC, donde el segundo codón T puede mutar a C. El resultado de la detección de la sonda it1532 es T, lo que sugiere un homocigoto salvaje (ATC/ATC). Para el sitio 1534, el homocigoto de tipo salvaje es TTC/TTC, y se ha informado que las tres bases de este codón son polimórficas. El resultado de la detección para la sonda fl15341/fl15341-2 es T, para sc1534/sc1534-2 es T/G y para la sonda fl15342 es C, lo que sugiere que este genotipo de locus es un genotipo heterocigoto TTC/TGC de tipo salvaje/mutante. . Los resultados completos de la detección muestran los genotipos específicos de tres loci del gen VGSC en la muestra.

Muestra (YB2) picos del sitio objetivo de la extensión de la sonda de masa. El resultado de la detección de la sonda vg1016 es T/G. El resultado de la detección de la sonda it1532 es T. El resultado de la detección de la sonda fl15341/FL15341-2 es T. El resultado de la detección de la sonda sc1534/SC1534-2 es T/G. El resultado de la detección de la sonda fl15342 es C

Los loci del gen VGSC de 13 Ae. Los mosquitos albopictus se identificaron con precisión utilizando nuestro método de tecnología de minisecuenciación MPCR-MS, que se confirmó mediante secuenciación de genes (Tabla 5).

Después de la optimización, las concentraciones finales de las siete sondas de masa fueron 8,30 μmol/L (vg1016), 6,87 μmol/L (it1532), 10,12 μmol/L (fl15341), 8,91 μmol/L (fl15341-2), 9,22 μmol/L. (sc1534f), 10,18 μmol/L (sc1534-2) y 7,15 μmol/L (fl15342).

La Figura 3a-c muestra la m/z de las siete sondas de masa sin expansión, el pico de las 7 sondas de masa para el sitio objetivo de extensión en diferentes concentraciones y las 7 sondas de masa con expansión para el control en blanco, respectivamente. Los límites de detección de las siete sondas de masa (vg1016, it1532, fl15341, fl15341-2, sc1534, sc1534-2, fl15342) fueron 200 ag/μl, 200 ag/μl, 2 fg/μl, 200 ag/μl, 2 fg /μl, 200 ag/μl y 20 fg/μl, respectivamente. El límite de detección total de todos los sitios en la tecnología de minisecuenciación MPCR-MS fue de 20 fg/μl cuando se utilizó la concentración diluida de los plásmidos de ADN sintético sin la mutación del gen VGSC (Fig. 3).

Límite de detección de siete sondas de masa: picos de MS de siete sondas de masa sin extensión; b la concentración de los picos del sitio objetivo de la extensión de la sonda de masa. c Control en blanco, sin picos del sitio objetivo de la plantilla de ADN de la extensión de la sonda de masa

Los resultados de detección de 70 muestras obtenidas mediante la tecnología de minisecuenciación MPCR-MS son consistentes con los resultados de la secuenciación. Los genotipos de los tres loci del gen VGSC en cada muestra se pueden identificar correctamente utilizando nuestro método (Tabla 6). Un archivo adicional muestra esto con más detalle (ver archivo adicional 3).

En medio de la rápida aparición de nuevos mutantes de Ae. albopictus VGSC, los investigadores están intentando desarrollar métodos de detección rápidos y convenientes además de la secuenciación de ADN convencional. La tecnología existente no puede detectar todas las mutaciones simultáneamente. La PCR junto con la tecnología de secuenciación de primera generación se considera actualmente el estándar de oro para la detección de mutaciones VGSC en Ae. albopictus, que requiere dos PCR para amplificar el gen diana seguidas de una secuenciación de primera generación. Luego, estos sitios de mutación identificados deben examinarse manualmente, lo cual es un proceso complicado, que requiere mucho tiempo y alto costo. Además, la AS-PCR es propensa a la contaminación y tiene baja especificidad [19, 25], lo que la hace inadecuada para la detección de múltiples muestras. Por el contrario, el método de tecnología de minisecuenciación MPCR-MS que desarrollamos en este estudio podría detectar múltiples sitios de mutación en el gen VGSC en 96 muestras en siete horas. Puede detectar simultáneamente tres sitios de mutación (loci 1016, 1532 y 1534) e identificar el genotipo mutante y su correspondiente secuencia de aminoácidos. Esta tecnología se ha aplicado para detectar COVID-19 y Mycoplasma pneumoniae [22, 24]. Ae. albopictus es un organismo eucariota multicelular. En comparación con nuestros estudios anteriores, este estudio incluyó la extracción de ADN de Ae. albopictus en lugar de la extracción de ARN y el diseño de cebadores y sondas para los sitios objetivo. La extracción de ADN es relativamente sencilla en comparación con la extracción de ARN. Mientras tanto, los sitios de mutación VGSC de Ae. albopictus en este estudio fueron menos comunes que las mutaciones estudiadas en otros microorganismos, y el diseño de cebadores y sondas fue menos desafiante.

El método que desarrollamos aquí tiene varias ventajas sobre los métodos tradicionales. En primer lugar, la minisecuenciación MPCR-MS requiere menos productos de PCR y menos secuenciación que la PCR convencional junto con secuenciación. El sistema de PCR convencional es un sistema de 25 μl [12, 21], mientras que nuestro método recientemente establecido es un sistema de solo 10 μl, lo que reduce en gran medida el consumo de reactivos y suministros. El método establecido en este estudio redujo en gran medida el costo del experimento, que es crucial en los países menos desarrollados de Asia, África y América Latina [26,27,28], donde existen enfermedades infecciosas transmitidas por mosquitos como el dengue, chikungunya y Zika [11]. El bajo costo y la conveniencia hacen de nuestro método una gran aplicación.

Este método se basa en la detección de sondas masivas después de la amplificación por PCR, que mostró una alta precisión sin identificación errónea en este estudio. Las muestras que utilizamos fueron un homocigoto de tipo salvaje, cinco heterocigotos mutantes y de tipo salvaje, cuatro mutantes homocigotos y un heterocigoto mutante (Tabla 2). También aplicamos este método a 70 muestras recolectadas en la naturaleza. Los resultados de detección de todas las muestras son consistentes con los resultados de la secuenciación, lo que sugiere la alta precisión de nuestro método al analizar muestras. Primero, los resultados de detección de la tecnología de minisecuenciación MPCR-MS mostraron la base en la posición medida después de cada extensión de la sonda, y luego se pudo determinar el genotipo de cada sitio de mutación del gen VGSC. Finalmente, se pudieron determinar los genotipos de los tres loci del gen VGSC en cada muestra. Los genotipos de los tres sitios se identificaron correctamente de acuerdo con nuestras reglas de juicio (Tablas 5, 6), que fueron consistentes con los resultados de la secuenciación. La confiabilidad del método fue verificada por las muestras de detección, lo que indicó que el método tiene valor de aplicación.

Nuestro método también tiene una alta sensibilidad. En comparación con los métodos de detección basados ​​en PCR convencional o tecnología de secuenciación de primera generación, la minisecuenciación MPCR-MS requiere menos productos de PCR y al mismo tiempo mantiene una alta sensibilidad. Utilizamos 20 fg/μl como LDL de este método. Sin embargo, el límite de detección varía entre las diferentes sondas. Por ejemplo, el límite de detección de fl15341 fue de 2 fg/μl después de la extensión de la sonda masiva, mientras que el de fl15342 fue de solo 20 fg/μl de copias. Aunque estas dos sondas están en el mismo fragmento de amplificación por PCR, nuestros resultados sugieren que la eficiencia de extensión de la sonda de fl15342 fue mucho menor que la de fl15341.

Este método no solo puede detectar 17 genotipos en los tres sitios considerados en este estudio, sino que también puede adaptarse para detectar otros cambios de aminoácidos informados, como las mutaciones TCG(S), CGC(R) y TGG(W) en el locus 1534. 20]. Si los resultados de la detección de la sonda de fl15341-2, c1534-2 y fl15342 fueron T, C y G, entonces el genotipo se confirmó como S/S (TCG/TCG). Además, este método es extensible y puede usarse para detectar nuevos genotipos mutantes en loci polimórficos previamente identificados. Cuando se descubre un nuevo sitio de mutación, la detección se puede lograr agregando una sonda correspondiente al nuevo sitio de mutación.

Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones. En primer lugar, se fija la secuencia del terminal 3' de la sonda de extensión y la calidad de la sonda se ve influenciada significativamente por la secuencia de bases cerca del sitio de detección [22]. En este estudio se descubre que cuando la sonda se hibrida con la cadena plantilla, la falta de coincidencia de codones entre la sonda y la cadena plantilla conducirá a una detección ineficaz. Cuando se produce una falta de coincidencia, cuanto más cerca esté del codón detectado, más probabilidades habrá de que se produzca una detección ineficiente. Por ejemplo, cuando se prueba el locus 1534 (TCC/TCC) en la muestra MS5, el mutante es homocigoto debido al cambio de mutación del segundo codón T a C. Para el primer codón, se detecta la sonda fl15341 (diseño inverso). y el codón terminal 3' de la sonda es A, que no coincide con el segundo codón C de la muestra de MS5, lo que provoca que esta sonda no se extienda (archivo adicional 2b MS5-A). Para resolver este problema, la sonda fl15341-2 (diseño delantero) compensa la falta de la sonda fl15341 (archivo adicional 2b MS5-B). De manera similar, la sonda sc1534-2 compensa la falta de la sonda sc1534. Sin embargo, esta conclusión no es absoluta. Por ejemplo, al detectar el locus 1534 (CTC/CTC) de la muestra SZ48, la sonda sc1534-2 se diseñó en dirección directa y el codón 3'-terminal era A, que no coincide con el primer codón C. El segundo codón T todavía se detectó correctamente (archivo adicional 2b SZ48-B). En resumen, cuando la sonda se hibrida con la cadena plantilla, la falta de coincidencia de codones entre la sonda y la cadena plantilla puede conducir a una detección ineficaz. En segundo lugar, hay mutaciones TCG(S), CGC(R) y TGG(W) en el locus 1534, que no se probaron en este estudio debido a la falta de muestras con estos genotipos.

La tecnología de minisecuenciación MPCR-MS es un método novedoso y sencillo para detectar mutaciones del gen VGSC en Ae. albopictus. Con la alta precisión, alta sensibilidad, ahorro de tiempo y ventajas económicas de esta tecnología, tiene un gran potencial en la vigilancia de mosquitos, especialmente en países asiáticos, africanos y latinoamericanos que se ven gravemente afectados por enfermedades infecciosas transmitidas por insectos.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Canal de sodio dependiente de voltaje

Reacción en cadena de la polimerasa multiplex

Tecnología de minisecuenciación de espectrometría de masas y PCR múltiple

Ionización por desorción láser asistida por matriz: espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Polimorfismo de nucleótido simple

PCR específica de alelo

Relación masa-carga

Fosfatasa alcalina de camarón

Trifosfatos de nucleósidos desoxigenados

Límite de detección más bajo

Ácido 3-hidroxipiridin-2-carboxílico

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Los autores agradecen a todos los participantes en este estudio.

Esta investigación fue financiada por el Gran Proyecto Nacional de Ciencia y Tecnología de China (No. 2018ZX10101002-002).

Laboratorio Nacional Clave de Seguimiento y Pronóstico Inteligente de Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional para el Control y la Prevención de Enfermedades Transmisibles, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades, Beijing, 102206, República Popular China

Qunzheng Mu, Xin Zhao, Wenyu Li, Xinchang Lun, Yiguan Wang, Dongdong Hua, Qiyong Liu, Di Xiao y Fengxia Meng

Hospital Popular Weifang No. 2, Weifang, 261000, Shandong, República Popular China

Qunzheng Mu

Facultad de Medicina de Weifang, Weifang, 261000, Shandong, República Popular China

Feng Feng Li

Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades del Distrito Daxing de Beijing, Beijing, 102600, Beijing, República Popular China

Xinxin Zhou

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Adquisición de datos, QZM, XZ, FFL, XXZ, XCL, WYL, DDH y FXM. Clasificación y análisis de datos, QZM. Adquisición de financiación, DX y XMF. Metodología, software, QZM. Supervisión, FXM, YGW y QYL. Redacción de borradores, QZM. Escritura: revisión y edición, YGW, XZ, DX y FXM. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. QZM y XZ contribuyeron igualmente a este trabajo. El orden de los autores se determinó tanto alfabéticamente como por orden creciente de antigüedad.

Correspondencia a Di Xiao o Fengxia Meng.

Este estudio fue apoyado por el Comité de Revisión Ética del Instituto para el Control y la Prevención de Enfermedades Infecciosas, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (No. ICDC-202304).

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La secuenciación de rutina se utilizó para detectar genes VGSC en 70 muestras recolectadas en la naturaleza.

Se utilizó un total de 13 muestras para establecer la tecnología de minisecuenciación MPCR-MS. Picos de MS de las sondas MPE.

Los resultados de la detección de 70 muestras utilizando tecnología de minisecuenciación MPCR-MS.

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Reimpresiones y permisos

Mu, Q., Zhao, X., Li, F. et al. Una nueva estrategia para detectar mutaciones en el gen del canal de sodio dependiente de voltaje de Aedes albopictus basada en tecnología de minisecuenciación por espectrometría de masas y PCR múltiple. Infect Dis Poverty 12, 74 (2023). https://doi.org/10.1186/s40249-023-01122-y

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Recibido: 17 de abril de 2023

Aceptado: 20 de julio de 2023

Publicado: 15 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40249-023-01122-y

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