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Jun 03, 2024

Investigadores de oncología: ¿Están aprovechando al máximo sus datos de PCR digital?

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El cáncer aparentemente puede cambiar en un abrir y cerrar de ojos, lo que hace que la detección y el seguimiento sean increíblemente urgentes. Para realizar pruebas rápidas, sensibles y precisas del ADN tumoral, los investigadores del cáncer confían cada vez más en la PCR digital (dPCR). Sin embargo, al realizar estas mediciones, hay poco margen de error. Aquí analizaremos cómo son los buenos datos de dPCR, cómo los equipos deficientes pueden restar calidad a los datos y qué pueden hacer los investigadores de oncología para obtener datos de dPCR de alta calidad que proporcionen información precisa y eficiente sobre la carga tumoral.

Para muchos cánceres, cuanto antes comience el tratamiento, mayor será la ventana de tratamiento y más probabilidades tendrá de sobrevivir el paciente. Sin embargo, según la composición genética de un tumor, algunos tratamientos pueden ser más efectivos que otros. La secuenciación de próxima generación puede acelerar la selección del tratamiento adecuado al identificar biomarcadores moleculares en el tumor que provocan la enfermedad o lo hacen resistente a los medicamentos.

Posteriormente, muchos investigadores están explorando el uso de una técnica no invasiva llamada biopsia líquida para rastrear estos biomarcadores. Esta técnica evalúa el ADN tumoral circulante (ctDNA) para medir biomarcadores en la sangre y otros fluidos corporales. Los datos de la biopsia líquida pueden brindar información sobre la carga tumoral, indicar el pronóstico y guiar las decisiones de tratamiento sobre cuándo administrar una terapia elegida y durante cuánto tiempo. Estos conocimientos tienen un potencial significativo para permitir un tratamiento del cáncer más eficaz y personalizado en el futuro.

El ctDNA se produce en niveles minúsculos en las muestras de biopsia líquida, por lo que es fundamental utilizar tecnología altamente sensible, como la dPCR, para garantizar resultados precisos. Sin embargo, al comparar los numerosos sistemas dPCR disponibles, los diferentes diseños de instrumentos producen datos de diferente precisión, exactitud y sensibilidad. Los datos inconsistentes socavan los éxitos abrumadores observados en la investigación de biomarcadores en su conjunto. En última instancia, para que la biopsia líquida pase al uso clínico estándar, los investigadores en oncología necesitan herramientas y reactivos en los que se pueda confiar para producir datos de biomarcadores de la más alta calidad posible.

Todos los enfoques de dPCR están diseñados para lograr pruebas de ácido nucleico extremadamente exactas y precisas, proporcionando una cuantificación absoluta de las especies objetivo. Un ensayo de dPCR implica dividir una muestra en miles de unidades separadas, cada una de las cuales contiene una o varias cadenas de ADN. Esto se puede hacer en un microarray, en un chip de microfluidos, en placas de microfluidos cuantitativas similares a las de PCR o, en el caso de Droplet Digital PCR (ddPCR), en una emulsión de aceite y agua. A continuación, se produce una reacción de PCR en cada partición y las sondas fluorescentes amplifican el ácido nucleico objetivo. Al final de la reacción, se evalúan las particiones para detectar fluorescencia positiva o negativa. Los investigadores utilizan la estadística de Poisson para determinar la concentración de ácido nucleico objetivo en la muestra original.

A diferencia de la PCR cuantitativa (qPCR), los ensayos de dPCR no requieren que los investigadores procesen sus muestras a lo largo de una curva estándar para interpretar los resultados, lo que reduce la posibilidad de error humano. También hace posible la alta sensibilidad y el alto límite de detección de los ensayos de dPCR, haciéndolos capaces de evaluar muestras que contienen menos del uno por ciento de una especie objetivo, lo que suele ser el caso de las muestras de biopsia líquida.

Como ocurre con cualquier tecnología, el tipo de instrumento, la calidad de los reactivos y la capacidad del usuario afectan la confiabilidad de una biopsia líquida evaluada con dPCR. Debido a que ciertos elementos de los instrumentos y ensayos de dPCR varían, no todos los instrumentos producirán datos de la misma calidad. Si bien es preferible elegir un sistema que produzca resultados a bajo costo, con un flujo de trabajo simple y un tiempo reducido entre la muestra y los resultados, los investigadores también deben priorizar la calidad de las pruebas de ctDNA para seleccionar un instrumento que agregue información real a su investigación.

La conclusión: los investigadores sólo pueden actuar sobre la base de los datos de los biomarcadores si pueden confiar en los resultados de sus ensayos de dPCR. Entonces, ¿cómo son los buenos datos?

Los datos de dPCR deben ser binarios, lo que significa que los puntos positivos y negativos en un gráfico están claramente separados por un umbral (Figura 1). Los conjuntos de datos de dPCR incorrectos tienen una separación deficiente entre las particiones positivas y negativas y pueden mostrar una gran cantidad de ruido, lo que hace que sea difícil establecer un umbral. Los datos incorrectos pueden deberse a varios problemas, como un ensayo o instrumento defectuoso o un inhibidor que afecte al ensayo. Cuando esto sucede, el investigador debe repetir el ensayo, lo que retrasa la información crítica sobre cómo responde un tumor al tratamiento y cuesta dinero adicional.

Buenos datos

Datos incorrectos

Los datos incorrectos aparecen en diversas formas que pueden proporcionar información sobre el origen del problema (Figura 2). Intentar interpretar cualquiera de estos tipos de datos conlleva un alto riesgo de cuantificación inexacta.

● Las particiones positivas aleatorias aparecen dispersas como lluvia en el gráfico. Este problema ocurre cuando el objetivo ha amplificado el ADN a una velocidad variable en todas las particiones. Puede indicar un ensayo de baja especificidad, una partición deficiente de la muestra o ruido del instrumento. Debido a que las particiones positivas y negativas se mezclan, no es fácil trazar un umbral, lo que reduce el límite de detección.

● La inestabilidad del hardware puede provocar amplitudes inconsistentes dentro de las particiones positivas y negativas, lo que hace que no quede claro dónde dibujar el umbral. Un usuario experimentado debe intentar dibujar el umbral e interpretar los resultados manualmente para darles sentido. Sin embargo, esto introduce la posibilidad de error humano, reduciendo así la sensibilidad.

● El ruido y la inestabilidad óptica hacen que los datos con puntos negativos se agrupen por encima del umbral. Este tipo de datos suele ser el resultado de burbujas, contaminantes sólidos o problemas ópticos con el instrumento. Una vez más, un usuario bien capacitado puede entender manualmente estos resultados, pero el proceso consume el valioso tiempo del investigador e introduce errores humanos, lo que reduce la sensibilidad del ensayo.

● La contaminación cruzada ocurre cuando el ADN objetivo se mueve de una partición a otra vecina. Este problema puede surgir por error del usuario, factores ambientales o dispersión de la muestra causada por el propio instrumento. La contaminación cruzada hace que las particiones negativas parezcan verdaderamente positivas, lo que hace imposible confiar en los resultados. Los investigadores pueden determinar si la contaminación cruzada ha afectado sus ensayos observando los controles sin plantilla que no deberían producir puntos de datos positivos. Los ensayos de dPCR que se ejecutan en microarrays y chips de placas son particularmente propensos a este problema, mientras que los ensayos de ddPCR realizados en emulsiones de aceite y agua no lo son.

Las áreas de investigación altamente prometedoras apuntan a utilizar pruebas de ctDNA durante todo el tratamiento del cáncer: durante la terapia neoadyuvante para evaluar rápidamente el estado del tumor y la eficacia de los fármacos, después de procedimientos curativos para medir la carga tumoral residual y durante el seguimiento a largo plazo para detectar la recurrencia del tumor lo antes posible. . Para que esta investigación avance sin obstáculos y se convierta en un estándar en la atención clínica, es fundamental utilizar tecnología que genere datos de la más alta calidad para determinar la utilidad de cada uno de estos enfoques.

Al recurrir a instrumentos, reactivos y métodos de alta calidad para avanzar en su trabajo, los investigadores en oncología pueden avanzar con confianza, manteniendo el ritmo de la naturaleza urgente del tratamiento del cáncer. De esta manera, pueden garantizar que su trabajo mejorará continuamente el estándar de atención para futuros pacientes con cáncer.