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Jan 09, 2024

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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4241 (2023) Citar este artículo 424 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics Como parte de la pandemia de COVID-19, los laboratorios clínicos se han enfrentado a

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 4241 (2023) Citar este artículo

424 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

Como parte de la pandemia de COVID-19, los laboratorios clínicos se han enfrentado a aumentos masivos en las pruebas, lo que ha provocado escasez de sistemas de recolección de muestras, reactivos y personal. Utilizamos muestras de gárgaras salinas recolectadas por nosotros mismos para optimizar las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex del SARS-CoV-2 de alto rendimiento con el fin de minimizar el costo y el tiempo del tecnólogo. Esto se logró mediante la eliminación de la extracción de ácidos nucleicos y la automatización del manejo de muestras en un manipulador robótico de líquidos ampliamente disponible, Hamilton STARlet. Se desarrolló un script de escaneo de códigos de barras personalizado para leer la identificación de la muestra mediante el sistema de software de Hamilton STARlet para permitir el muestreo de tubos primarios. El uso de mezclas de reacción de ensayo de SARS-CoV-2 precongeladas redujo el tiempo de preparación del ensayo. Tanto en la validación como en las pruebas en vivo, el ensayo no produjo resultados falsos positivos ni falsos negativos. De las 1060 muestras analizadas durante la validación, el 3,6 % (39/1060) de las muestras requirieron volver a analizarse porque eran positivas para un solo gen, presentaban una falla en el control interno o un error de aspiración de líquido. Aunque el tiempo de respuesta general fue sólo ligeramente más rápido en el flujo de trabajo automatizado (185 minutos frente a 200 minutos), hubo una reducción del 76 % en el tiempo práctico, lo que potencialmente redujo la fatiga y el agotamiento del personal. Este proceso descrito, desde la autorecogida de muestras hasta las pruebas de PCR directas automatizadas, reduce significativamente la carga total de los sistemas sanitarios en términos de recursos humanos y requisitos de reactivos.

La recolección de muestras de hisopos nasofaríngeos (NPS) todavía se considera el estándar de oro para la detección diagnóstica del SARS-CoV-21,2. Este modo de recolección de muestras tiene inconvenientes, como la incomodidad para el paciente y requiere muchos recursos, ya que requiere un trabajador de atención médica (PS) dedicado para recolectar o supervisar con precisión el proceso de recolección de muestras. Un rendimiento deficiente del muestreo de NPS puede dar lugar a resultados falsos negativos debido a una recogida de muestras inadecuada o inadecuada. Para abordar esto, durante la pandemia de COVID-19 se buscaron activamente tipos de muestras alternativos que fueran fáciles de administrar, preferiblemente mediante autocolección. La saliva fue el primer tipo de muestra no invasiva y sin NPS validada y se encontró que tenía un rendimiento similar al tipo de muestra NPS estándar de oro3,4,5,6. La observación empírica de que el virus SARS-CoV-2 es estable durante > 72 h en esta matriz7 y, por lo tanto, no requiere dispositivos de recolección ni conservantes especializados, abrió posibilidades para realizar la recolección de muestras autoadministrada en el hogar. El desarrollo de protocolos de PCR "sin extracción"8,9 mediante los cuales la saliva se agrega directamente a la mezcla de reacción del ensayo RT-qPCR sin un procesamiento extenso de purificación de ARN, mejoró aún más la aceptabilidad clínica de este tipo de muestra5. Esto llevó a que la Administración Federal de Medicamentos (FDA) aprobara muestras de saliva y un protocolo de PCR directa para pruebas de saliva, llamado Saliva Direct10, para la detección del SARS-CoV-2 según las regulaciones de autorización de uso de emergencia (EUA).

A pesar de los beneficios de la saliva como alternativa simplificada al muestreo de NPS, su implementación práctica para la detección de alto rendimiento del SARS-CoV-2 ha demostrado ser un desafío para los laboratorios de diagnóstico11. La saliva cruda es viscosa y puede congelarse poco después de su recolección6. Esto dificulta el pipeteo manual o en un manipulador de líquidos automatizado. Se requieren pasos discretos para reducir su viscosidad, que incluyen la dilución en tampones específicos4,12,13 o la incubación con Proteinasa-K5, seguida de un tratamiento térmico (95 °C durante 30 min), para inactivar el agente desproteinizante. Estos pasos preanalíticos, aunque fáciles de implementar, deben realizarse manualmente, lo que impone una carga de trabajo adicional al laboratorio clínico. Para paliar esto, se ha sugerido la recolección de saliva en un medio líquido como el medio de transporte universal/viral (UTM/VTM)14. Sin embargo, la naturaleza inhibidora de estos agentes de licuefacción/estabilización dificulta la implementación del protocolo Saliva Direct original, lo que obliga a los laboratorios de diagnóstico a procesar muestras de saliva utilizando métodos estándar de purificación de ARN15,16,17. Esta vía de prueba no solo requiere mucho tiempo sino que es contraria a los objetivos originales del protocolo Saliva Direct, que buscaba hacer que las pruebas de SARS-CoV-2 fueran asequibles, especialmente para entornos con recursos limitados.

En la segunda mitad de 2020, dos grupos18,19 informaron de forma independiente el uso de enjuagues bucales salinos (gargarismos salinos) para detectar la presencia del SARS-CoV-2. En lo sucesivo denominada gárgaras con solución salina, la recolección de este tipo de muestra podría realizarse sin la necesidad de un trabajador sanitario dedicado tanto en adultos como en niños (normalmente > 4 años), preservando al mismo tiempo su rendimiento en comparación con el NPS recolectado por los trabajadores sanitarios20,21. recursos clínicos y dispositivos de recolección de NPS guardados, que eran críticamente escasos en ese momento22. Estudios adicionales demostraron que las gárgaras con solución salina también se podían realizar mediante PCR sin extracción, pero a diferencia de la saliva, no requerían un procesamiento preanalítico complejo debido a su consistencia acuosa23,24. La simplicidad de este proceso abrió la posibilidad de automatizar el proceso de prueba en un manipulador de líquidos. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue describir la optimización y la implementación de la prueba de PCR múltiple Spike/ORF8/RNaseP (SORP) en el formato Gargle Direct-PCR (GDirect-PCR) en una plataforma automatizada de manipulación de líquidos: el Microlab STARlet ( Hamilton Robotics, NV, EE. UU.), en adelante denominado Hamilton GDirect-PCR (HGDirect-PCR).

Las pruebas iniciales sobre la viabilidad del uso de la PCR directa en muestras de gárgaras con solución salina se realizaron en una cohorte de 38 muestras positivas y 75 negativas de SARS-CoV-2 utilizando dos ensayos: el N1/N2 US-CDC y el SORP (versión 1). El ensayo Nucleocapsid de los CDC de EE. UU. detectó los objetivos N1 en las 38 muestras positivas de gárgaras con solución salina utilizando el método GDirect-PCR; sin embargo, cuatro muestras dieron resultados falsamente negativos para el objetivo N2 (número de muestra: FS5, FRS10, FRS16 y FRS18) (Tabla 1). Cuando se analizaron las mismas muestras utilizando el protocolo estándar basado en extracción de ARN, no se registraron resultados falsos negativos. Los aumentos medios en el valor de CT entre el ARN extraído estándar y el enfoque de PCR directa para los objetivos de los genes N1 y N2 fueron 2,74 y 5,74 respectivamente. El control interno RNaseP se detectó en todas las muestras de gárgaras positivas y negativas tanto en el método estándar como en el método sin extracción.

Cuando se analizaron las mismas 38 muestras positivas para gárgaras con solución salina en el ensayo SORP (versión 1), utilizando el protocolo de extracción de ARN estándar, se detectaron dianas genéticas tanto S como ORF8 en todas las muestras, incluido el control interno RNaseP (Tabla 1). Cuando se analizaron mediante GDirect-PCR, se detectaron tanto S como ORF8 en todas las muestras excepto en dos: FRS15 (Spike y ORF8 negativo) y FRS18 (Spike negativo, ORF8 positivo) (Tabla 1). Los aumentos medios en el valor de CT entre el ARN extraído estándar y el enfoque de PCR directa para los objetivos de los genes S y ORF8 fueron 4,24 y 2,63 respectivamente. No se detectaron falsos positivos entre las 75 muestras de gárgaras negativas para el SARS-CoV-2 analizadas con el protocolo GDirect-PCR. Esto le dio al proceso GDirect-PCR un porcentaje de acuerdo positivo del 97,37 % (IC del 95 %: 86,2–99,9 %) y un acuerdo general del 99,12 % (IC del 95 %: 95,2–99,9 %) con respecto al ensayo de referencia.

Cuando aplicamos el ensayo SORP original (versión 1) en una cohorte (n = 200) de muestras de gárgaras con solución salina positivas para SARS-CoV-2, notamos dos problemas (a.) la pérdida del objetivo del gen de pico en aproximadamente el 7% de los muestras positivas y (b.) fuerte señal de RNaseP de muestras clínicas (CT = 18–28). Si bien la presencia de grandes cantidades de células humanas en las muestras de gárgaras con solución salina explica la fuerte señal de la RNasaP, la frecuente desaparición del objetivo del gen de la espiga fue inesperada. Cuando se volvieron a analizar las mismas muestras positivas de un solo objetivo (S-/ORF8+) utilizando ARN extraído, se detectó consistentemente una amplificación positiva para el gen de la espiga. La manipulación de las concentraciones individuales de los cebadores Spike-F1/-R1 y la sonda Spike-P1 no corrigió el problema (datos no mostrados).

La temperatura de recocido óptima se determinó mediante PCR con gradiente de temperatura (60 °C a 68 °C) en una cohorte de muestras positivas para gárgaras con solución salina (Fig. 1). Si bien la temperatura de recocido (60 °C a 63 °C) no tuvo un efecto apreciable en el perfil de amplificación del objetivo del gen ORF8, el gen de pico mostró una amplificación óptima a temperaturas de recocido de > 65 °C (Fig. 1). Esto sugirió que la temperatura de hibridación de PCR de 60 °C, establecida en el ensayo SORP versión 1 original para plantillas de ARN purificadas, no era óptima para las plantillas de gárgaras con solución salina utilizadas en condiciones de PCR directa. Cuando se extrajo ARN de muestras de gárgaras con solución salina y se usó como plantilla purificada, ambos objetivos S/ORF8 se amplificaron de manera óptima a 60 °C (Fig. 4_suppl) y cualquier desviación de esta temperatura (> 60 °C) resultó en una disminución gradual. en la señal de detección de ambos objetivos. Esto sugirió que el rendimiento del objetivo del gen de pico estaba influenciado tanto por la temperatura como por la naturaleza de la plantilla de entrada (ARN purificado frente a gárgaras con solución salina no purificada). La amplificación de ORF8 no se vio afectada por el tipo de plantilla de entrada, pero un aumento en la temperatura desde los 60 °C óptimos resultó en una amortiguación de la señal de amplificación (Fig. 4_Suppl).

Ejemplo representativo de tres muestras de gárgaras con solución salina analizadas mediante PCR sin extracción mediante el ensayo SORP versión:1. Variación en la intensidad de la señal de los genes S y ORF8, a diferentes temperaturas de hibridación (60 °C a 68 °C) cuantificada en unidades relativas de fluorescencia (RFU). Según lo especificado por el fabricante de la mezcla Luna Probe One-Step RT-qPCR, se consideró 60 °C como la temperatura de recocido óptima y se utilizó como temperatura de referencia.

Para abordar el rendimiento subóptimo del objetivo del gen de pico, truncamos el cebador directo de pico original Spike-F123, lo que resultó en su amplificación óptima a 60 °C en GDirect-PCR (Fig. 5_suppl). Este nuevo cebador de púas truncada, denominado Spike-F1-M4, reemplazó al cebador Spike-F1 original. La aplicación del nuevo Spike-F1-M4 dio como resultado una amplificación óptima de los objetivos del gen Spike y ORF8 utilizando una temperatura de recocido de 60 °C en GDirect-PCR.

El nuevo cebador RNaseP R-3 de baja eficiencia dio como resultado una señal más débil (aumento en un promedio de 3 a 4 valores de CT) en el control de ADN humano cuando se probó en una cohorte (n = 12) de muestras negativas para hacer gárgaras (Fig. 6_suppl). El uso del cebador Spike-F1-M4 con los cebadores de amplificación de RNaseP más débiles mejoró la detección de ambos objetivos S/ORF8 cuando se probó en muestras de gárgaras de SARS-CoV-2 previamente positivas (Fig. 7_suppl).

La inactivación por calor de las muestras de gárgaras con solución salina a 65 °C durante 1 h no produjo una pérdida significativa en la señal del gen E (Fig. 2). El cambio medio de CT fue ΔCT = + 0,16 antes y después del calentamiento. El ΔCT medio fue de -0,26 y -0,17 cuando la misma cohorte de muestras calentadas se almacenó a 4 °C y temperatura ambiente durante 24 h, respectivamente, antes de la prueba.

Variación de la señal del gen E de muestras de gárgaras con solución salina analizadas para detectar SARS-CoV-2 después de la inactivación por calor (65 °C durante 60 min). Se almacenó una alícuota de la muestra calentada a 4 °C y temperatura ambiente (RT), durante 24 h, antes de la detección del gen E. Control = muestra original analizada inmediatamente después de la inactivación por calor.

En una placa de 96 pocillos que contenía 92 muestras replicadas, los valores CT promedio de los objetivos de los genes Spike y ORF8 fueron 28,56 (SD = 0,10) y 29,35 (SD = 0,10) respectivamente. El coeficiente de variación de los valores de CT para los objetivos del gen Spike y ORF8 fue del 0,35%. No se detectó contaminación cruzada en el esquema de dispensación en forma de tablero de ajedrez.

En la primera fase de validación, se analizaron en paralelo un total de 908 muestras clínicas de gárgaras con solución salina en el ensayo de referencia y en el flujo de trabajo HGDirect-PCR durante 10 días. Los resultados de HGDirect-PCR se registraron e interpretaron utilizando un algoritmo como se describe en la Fig. 3. El flujo de trabajo de HGDirect-PCR detectó 78 positivos (S+/ORF8+) del total de 87 positivos detectados por el ensayo de referencia (Tabla 2). . De los 9 positivos restantes, 6 muestras fueron positivas para un solo gen objetivo (S u ORF8), lo que las hace “indeterminadas” (“IND”), mientras que 3 muestras no arrojaron un resultado debido a una falla en la dispensación de líquido en el instrumento Hamilton Starlet. (“IVLD”) (Tabla 2). De las 821 muestras que dieron negativo en el ensayo de referencia, 793 se clasificaron como negativas (S-/ORF-/RNaseP+) mediante el flujo de trabajo HGDirect-PCR (Tabla 2). Las 28 muestras restantes arrojaron un resultado discordante: 11 positivos de un solo gen ("IND"), 10 fallas de RNaseP ("IVLD") y 7 errores de dosificación de líquido ("IVLD"). Treinta y siete muestras del total de 908 muestras analizadas en el flujo de trabajo HGDirect-PCR habrían requerido una nueva prueba (Tabla 2) para confirmar los resultados, para una tasa de nueva prueba del 4,07 % (37/908). No se registraron falsos positivos ni falsos negativos en el flujo de trabajo de HGDirect-PCR, lo que le da a este proceso de prueba una sensibilidad y especificidad del 100 %, con una precisión de detección del 95,9 % siempre que se realizara una nueva prueba confirmatoria de las muestras que arrojaron un resultado IND/IVLD.

Algoritmo de interpretación para el flujo de trabajo HGDirect-PCR. Las muestras que arrojaron resultados IND (indeterminado) o IVLD (no válido) se enviaron para volver a analizarlas en el ensayo XpertXpress o BDMax SARS-CoV-2.

En la aplicación en vivo de la prueba HGDirect-PCR en 152 muestras de gárgaras con solución salina, se detectaron 8 positivos (8/152) y 144 negativos (144/152), con 2 resultados discordantes (Tabla 3). Estos dos resultados discordantes fueron positivos para un solo gen ("IND") o falla en la detección de RNaseP ("IVLD"), lo que resultó en una tasa de falla de la prueba del 1,3%. Estos resultados discordantes se resolvieron inmediatamente en el ensayo Xpert Xpress SARS-CoV-2 y resultaron negativos.

Para procesar 91 muestras de gárgaras salinas, hasta la etapa de ciclo de PCR, al tecnólogo le tomó un promedio de 125 minutos en el flujo de trabajo HGDirect-PCR, de los cuales solo 30 minutos fueron el tiempo práctico real (Fig. 4). Por el contrario, al tecnólogo le tomó 155 minutos con el método estándar, de los cuales 130 minutos fueron el tiempo práctico (Fig. 4), para configurar 91 muestras. Si se incluía el tiempo del ciclo de PCR, el proceso estándar tardó 200 minutos, mientras que HGDirect-PCR tardó 185 minutos en procesar un lote de 91 muestras de gárgaras con solución salina.

Tiempo de preparación (min) necesario para procesar 91 muestras de gárgaras con solución salina en (a) el proceso KingFisher ("proceso estándar") y (b) el proceso Hamilton-Direct ("HGDirect-PCR"). Tiempo de configuración (menos ciclos de PCR) requerido para (a) proceso KingFisher = 155 min (tiempo práctico = 130 min) y (b) HGDirect-PCR = 125 min (tiempo práctico = 30 min). El tiempo total (configuración + ciclos de PCR) para KingFisher y HGDirect-PCR es de 200 min y 185 min respectivamente.

Desde que la OMS declaró la COVID-19 pandemia mundial a principios de marzo de 2020, los laboratorios de diagnóstico experimentaron demandas sin precedentes para ampliar su capacidad de pruebas, lo que provocó escasez de personal y reactivos. Para aumentar la eficiencia del laboratorio, desarrollamos un ensayo de PCR directo más simple, eliminando la necesidad de extracción, y automatizamos el proceso para aprovechar las pruebas en tubo primario. Informes anteriores han descrito métodos de PCR directa que utilizan métodos manuales, pero son repetitivos, requieren mucho tiempo y contribuyen a la fatiga del personal. Curiosamente, hasta la fecha pocos estudios han descrito los beneficios de implementar un manipulador de líquidos automatizado en un flujo de trabajo de pruebas de PCR sin extracción. En un estudio realizado por Blairon et al.25, la plataforma de extracción Nimbus, que forma parte del sistema de prueba RT-qPCR del ensayo Allplex SARS-CoV-2 (Seegene Technologies, Corea), se reconfiguró para realizar un paso de predilución de la prueba clínica. muestra, seguido de su dispensación en la mezcla de ensayo, lo que resultó en un mejor rendimiento (86,4 frente a 97,8 %) y tiempo de respuesta (19:18 h frente a 09:03 h) con respecto al proceso manual. Si bien este estudio utilizó el tipo de muestra UTM, no conocemos ningún otro estudio en el que se haya utilizado un sistema de manipulación de líquidos para el procesamiento de PCR sin extracción en el tipo de muestra para gárgaras con solución salina.

Un beneficio adicional del proceso automatizado fue el uso de pruebas con tubos primarios. Para implementar esto, hicimos dos cambios en nuestro flujo de trabajo: (1.) se colocaron etiquetas de códigos de barras únicas en los tubos, que podían ser leídas por el sistema de escaneo de Hamilton STARlet y (2.) inactivamos las muestras con calor (65 ° C durante 60 min) en los tubos de recolección primaria, para que pudieran procesarse de manera segura en la plataforma abierta de Hamilton en un laboratorio estándar de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Se eligió la temperatura más baja de 65 °C con una duración más larga debido a preocupaciones sobre la integridad de los tubos de recolección de muestras primarias a 95 °C, que es más rápida pero tiene un efecto adverso en la señal de PCR posterior26,27.

En nuestra experiencia, la elección y optimización del ensayo múltiplex RT-qPCR del SARS-CoV-2 fue fundamental para el éxito final del proceso de PCR sin extracción. Esto se debe a que los ensayos multiplex RT-qPCR del SARS-CoV-2 publicados hasta la fecha se han desarrollado para la plantilla de ARN purificada del SARS-CoV-2. La adopción directa de estos ensayos multiplex en un flujo de trabajo sin extracción puede dar lugar a una amplificación subóptima. Por ejemplo, Vogel et al. (2020) observaron una pérdida aleatoria del objetivo del gen N2 SARS-CoV-2 cuando se utilizó el ensayo múltiplex N1/N2 autorizado por los CDC de EE. UU. en plantillas de saliva. Como resultado, el protocolo Saliva Direct autorizado por la FDA-EUA se basa en una única PCR del gen N1 del SARS-CoV-2 (con RNaseP humana como control de muestra) para la detección del SARS-CoV-210. También se han realizado observaciones similares en otras extracciones. -Estudios de PCR gratuitos en los que ciertas combinaciones multiplexadas de SARS-CoV-2 han dado como resultado tasas de detección más bajas. Por ejemplo, los objetivos del gen E/N1 en combinación múltiple tuvieron una tasa de detección de ~ 70 % en comparación con ORF1ab/N1 u ORF1ab/N2, que tenían > 98 % de sensibilidad analítica26. También notamos un rendimiento deficiente de nuestro ensayo S/ORF8 original donde se observó una abandono aleatorio del objetivo del gen S en el flujo de trabajo de GDirect-PCR. Sin embargo, esto se solucionó cuando se volvió a optimizar el ensayo (SORP versión 2). También nos gustaría agregar que, debido a las frecuentes mutaciones observadas en el gen S (https://covariants.org/), podría haber posibilidades de observar abandonos del gen S (S-/ORF8+). Obtener este resultado conduciría invariablemente a una carga excesiva de pruebas de confirmación adicionales según nuestro algoritmo de prueba (Fig. 3). En tales circunstancias, la medida correctiva más prudente sería realizar un análisis in silico detallado del conjunto de cebadores/sonda del gen S e implementar cualquier modificación potencial en su secuencia.

Las ganancias en la eficiencia de las pruebas a través del proceso HGDirect-PCR deben equilibrarse con la necesidad de aumentar las pruebas de confirmación. De las 908 muestras de gárgaras analizadas durante la validación de HGDirect-PCR, el 4,07 % (37/908) de las muestras requirieron volver a analizarse.

Este estudio tiene limitaciones. No analizamos muestras de NPS en nuestro sistema HGDirect-PCR. Esto se debía a que las puntas de las pipetas de manipulación de líquidos del Hamilton STARlet chocaban frecuentemente con los hisopos que todavía estaban presentes en los tubos de muestra primaria. Aunque una forma de evitar esto sería dispensar el líquido UTM/VTM en un tubo que no contenga hisopo, esto habría añadido un paso laborioso y que consumiría mucho tiempo, lo que eliminaría gran parte de los beneficios del proceso automatizado. Una limitación adicional de este estudio es la comparación del proceso de extracción manual existente con el proceso automatizado de PCR directa. Una alternativa habría sido la automatización de la carga de muestras en el instrumento de extracción estándar, que se implementó al finalizar el estudio. Esto tuvo algunas ventajas adicionales gracias a la reducción del tiempo de manipulación.

En resumen, las pruebas de PCR sin extracción directa para la detección del SARS-CoV-2 se pueden realizar desde tubos primarios en un manipulador de líquidos como el Hamilton STARlet. Con una optimización cuidadosa, la PCR directa se puede implementar de manera confiable en un flujo de trabajo automatizado, lo que ahorra tiempo al tecnólogo y potencialmente reduce la fatiga del personal para pruebas de gran volumen. El proceso descrito aquí puede ser de interés para los laboratorios clínicos interesados ​​en incorporar un manipulador de líquidos para realizar PCR de SARS-CoV-2 sin extracción en grandes volúmenes.

Se utilizaron muestras clínicas enviadas para pruebas de rutina de SARS-CoV-2 en los Laboratorios de Microbiología y Virología del BC Children's Hospital (BCCH). Se recolectaron muestras de niños y adultos sintomáticos, incluidos trabajadores de la salud, en nuestra clínica de pruebas de COVID-19 en el sitio, así como en una clínica de pruebas de COVID-19 con servicio de autoservicio en la comunidad. Como se describió anteriormente18, se indicó a los pacientes que observaran un video educativo (http://y2u.be/V9xonNTtApY; http://y2u.be/ZvqjkbD-moA) para la recolección de la muestra por sí mismos y se les proporcionó el kit de recolección. Las muestras se enviaron al laboratorio dentro de 1 a 6 h desde el momento de la recolección. Esta investigación se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y el estudio fue aprobado por la Junta de Ética en Investigación de la Universidad de Columbia Británica (H20-02538). Las muestras residuales se anonimizaron antes de su uso y se otorgó una renuncia al consentimiento para los fines de este estudio de validación del ensayo.

El ensayo principal de SARS-CoV-2 utilizado en el laboratorio de Microbiología y Virología fue desarrollado por el Laboratorio de Salud Pública del Centro para el Control de Enfermedades de la Columbia Británica (BCCDC). Este ensayo se centró en los genes RdRp y E del SARS-CoV-2, con la RNaseP humana como control interno28. Este ensayo, en adelante denominado "ensayo de referencia", se utilizó de forma rutinaria para analizar muestras clínicas. El ácido nucleico total (TNA) utilizado para este ensayo se purificó en el instrumento de extracción automatizado KingFisher Flex (ThermoFisher, Carlsbad, CA), utilizando el kit de aislamiento de ácido nucleico de patógenos virales MagMAX (ThermoFisher) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se transfirieron cinco microlitros del eluato de TNA final (50 µl), dispensados ​​en la placa de 96 pocillos KingFisher, a la placa ABI para el ensayo de RT-qPCR. Este flujo de trabajo, en adelante denominado "proceso de extracción estándar", se resume en la Fig. 4.

Las pruebas iniciales de PCR sin extracción se realizaron en una cohorte de 38 muestras positivas para SARS-CoV-2 y 75 muestras negativas de gárgaras con solución salina, previamente analizadas mediante el ensayo de extracción estándar. Las muestras se colocaron en un horno de convección de laboratorio a 65 °C durante 60 minutos para la inactivación viral y luego se enfriaron a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos. Luego se agregaron directamente manualmente 5 µl de la muestra primaria para hacer gárgaras a la reacción de RT-qPCR. Se utilizaron dos ensayos multiplex de SARS-CoV-2 separados para las pruebas: el ensayo triplex Spike-ORF8 (SORP)23 y el ensayo de nucleocápside N1/N2 US-CDC2.

El ensayo de PCR triplex SORP original23 requirió modificación antes de su implementación en HGDirect-PCR. Específicamente, el cebador Spike-F1 original se truncó para dar un nuevo cebador, Spike-F1-M4, y el cebador inverso RNaseP-R8 dirigido a ARNm RNaseP se reemplazó por un nuevo cebador RNaseP-R3 (ver resultados arriba). El ensayo SORP modificado se denomina “SORP versión: 2” (Tabla 4), para distinguirlo del ensayo SORP original23, en adelante denominado ensayo “SORP versión: 1”.

La PCR directa se realizó utilizando la mezcla Luna Probe One-Step RT-qPCR (n.º de catálogo: E3006E; New England Bio labs, Whitby, ON). Se agregaron cinco µL de la muestra de gárgaras salinas a 25 µL de la mezcla de reacción del ensayo que consistía en: 12,5 µL de mezcla de sonda Luna (2X), 1,25 µL de transcriptasa inversa (20X), cebadores Spike-F1-M4/R1 (0,4 µM cada uno). ), sonda Spike-P1 (0,2 μM), cebadores ORF8-F1/ORF8-R (0,4 μM), sonda ORF8-P (0,2 μM), cebadores RNaseP-F/R3 (0,2 μM) y sonda RNaseP-P (0,2 µM). La placa de reacción RT-qPCR de 96 pocillos se agitó (800 RPM durante 1 min) en un agitador ABI Digital Vortex-Genie 2 (Cole Palmer, Montreal, QC) para mezclar los componentes de la reacción. Las condiciones de ciclado para la PCR directa fueron: 55 °C durante 5 min, 60 °C durante 5 min (transcripción inversa), 95 °C × 60 s (activación enzimática) seguidos de 50 ciclos de 95 °C a 10 s y 60 °C a 60 s. El termociclado y la captura de fluorescencia se realizaron en el instrumento QuantStudio 6Pro (ThermoFisher). Para lograr eficiencia operativa, la mezcla maestra SARS-CoV-2 Luna RT-qPCR (que contiene cebadores y sondas S, ORF8 y RNaseP, y la enzima transcriptasa inversa) se preparó de antemano en grandes lotes. Cada lote (predispensado en tubos de 2 ml suficientes para una placa de 96 pocillos) se sometió a control de calidad y se almacenó congelado a -80 °C.

Para evitar la competencia entre la PCR de control interno y las PCR virales en muestras clínicas débilmente positivas, se diseñó un nuevo cebador inverso, RNaseP-R1, aproximadamente 89 pb aguas abajo del cebador RNaseP-R de US-CDC (Fig. 1_Suppl) en uso rutinario en Columbia Británica. Se sintetizó de forma personalizada una versión truncada del cebador RNaseP-R1 eliminando seis bases de su extremo 3'. Este nuevo cebador, designado como RNaseP-R3 (Fig. 1_Suppl), se probó en una muestra de conveniencia, que consistía en un conjunto de muestras de gárgaras con solución salina que previamente dieron negativo para SARS-CoV-2 utilizando el ensayo de referencia (E/RdRp/ ARNasaP).

Se utilizó una cohorte de nueve muestras de gárgaras con solución salina, que previamente dieron positivo para SARS-CoV-2, para estudiar el efecto de la inactivación por calor en la señal final de RT-qPCR. Las muestras de gárgaras individuales se inactivaron con calor como se describió anteriormente. Se guardaron alícuotas antes del calentamiento, el posenfriamiento y después de 24 h de almacenamiento a 4 °C y temperatura ambiente. Las alícuotas se enviaron para extracción de ARN y PCR para el gen E del SARS-CoV-229.

Después de registrar las muestras de pacientes utilizando el sistema SunQuest 6.4 (sistema de información Sunquest, Tucson, AZ), se aplicaron etiquetas de códigos de barras que incorporaban un número de muestra único a los tubos de muestra primarios (Fig. 2_Suppl). Luego se incubaron lotes de 91 tubos a 65 °C durante 60 minutos para inactivar el virus SARS-CoV-226,30 y luego se enfriaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se retiraron las tapas de los tubos mientras los tubos se cargaban en cuatro gradillas Hamilton de 24 tubos (Fig. 2_Suppl). En la última gradilla se cargaron dos controles positivos y negativos.

Los códigos de barras de los tubos se escanearon durante la carga utilizando el escáner de tubos integrado del Hamilton STARlet. Para manejar etiquetas potencialmente mal aplicadas, se escribió un método de escaneo que marcaba los tubos de muestra que no pudieron escanearse, dándole al operador la opción de rotar y volver a escanear el tubo de muestra con un escáner portátil o ingresar el número de muestra en el teclado. Luego, el método escribió tres archivos de Microsoft Excel que contienen identificaciones y ubicaciones de placas para (a.) todas las transferencias (b.) todas las transferencias exitosas y (c.) todas las transferencias fallidas. Se creó una macro utilidad en Microsoft Excel 2016 para aceptar los datos del código de barras de la muestra y convertirlos en un formato de placa de PCR de 96 pocillos para importarlos al software de diseño y análisis del instrumento QuantStudio 6Pro, versión 2.6 (ThermoFisher). En nuestro flujo de trabajo, esta interfaz macro de Excel estaba precargada en la computadora PC que controlaba el instrumento QuantStudio 6Pro.

Dado el tamaño del tubo primario, la transferencia de 5 µl de muestra de gárgaras con solución salina a la placa de reacción RT-qPCR requirió dos pasos de pipeteo (Fig. 2_suppl). En el primer paso, se transfirieron 100 µl de la muestra de gárgaras con solución salina a una placa intermedia (placa de 96 pocillos ABGene 1400; ThermoFisher) mediante una punta de pipeta de 1000 µl de capacidad de volumen. Después de esta transferencia, se dispensaron 5 µl de solución salina para hacer gárgaras desde la placa intermedia a la mezcla de ensayo de RT-qPCR utilizando una punta de volumen de 10 µl.

La primera transferencia utilizó la clase de líquido HighVolumeFilter_Glycerin80_DispenseSurface_Empty de Hamilton con las siguientes modificaciones: La detección del nivel de líquido se realizó solo por presión (configurada en alta sensibilidad) con la detección capacitiva desactivada para evitar que se activen las burbujas de la superficie. Se consideró que un espacio de aire de transporte de 10 µl era óptimo para evitar la formación de gotas sin permitir la inversión del límite aire-líquido dentro de las puntas. La dispensación de 10 µl utilizó la misma clase de líquido pero con detección capacitiva activada y un espacio de aire de transporte de 2 µl.

Antes de iniciar la validación del ensayo de PCR sin extracción utilizando el manipulador de líquidos Hamilton STARlet, se evaluaron dos parámetros de calidad (1.) precisión del pipeteo entre pocillos y (2.) evaluación de la contaminación cruzada.

Para lograr precisión en el pipeteo entre pocillos, se utilizó un conjunto de muestras positivas (CT: 18–20). Esta muestra se inactivó térmicamente como se describió anteriormente y se diluyó en 200 ml de solución salina (NaCl al 0,9%) para obtener un CT final de 27–29. Luego se dispensaron manualmente dos alícuotas de ml de esta muestra de gárgaras positiva diluida en 92 tubos primarios de recolección de gárgaras que tenían etiquetas de códigos de barras únicos y se colocaron en las rejillas de muestras de Hamilton STARlet. Después de dispensar la muestra (5 µl) mediante el manipulador de líquidos en la mezcla de reacción de RT-qPCR SORP versión 2, se realizó la PCR y se registraron los valores de CT de la señal S/ORF8 de cada una de las 92 reacciones. Como medida de precisión se calcularon el CT medio, la desviación estándar y el coeficiente de variación.

Para la evaluación de la contaminación cruzada, se utilizó un perfil de dispensación de "tablero de ajedrez" (Fig. 3_Suppl). Para lograr este perfil de dispensación, se insertó una cohorte de muestras de gárgaras positivas para SARS-CoV-2 (n = 12) en cada una de las cuatro rejillas de carga del Hamilton STARlet en las posiciones 10, 13 y 16 (tenga en cuenta que el Hamilton STARlet carga las placas verticalmente, no horizontalmente). En las posiciones restantes, se cargaron muestras de gárgaras con solución salina negativas para SARS-CoV-2 (n = 80) (Fig. 3_Suppl).

En la primera fase de validación, las muestras de gárgaras con solución salina recibidas en el Laboratorio de Microbiología y Virología del BCCH para las pruebas de SARS-CoV-2 se analizaron en el flujo de trabajo HGDirect-PCR utilizando la versión SORP: 2 del ensayo (Fig. 4). Estas muestras anónimas se analizaron previamente en el ensayo de extracción estándar (RdRp/E/RNaseP) (Fig. 4) y se analizaron en el ensayo HGDirect-PCR dentro de las 12 h posteriores a su recepción. La prueba prospectiva se realizó durante 10 días consecutivos y se analizaron 908 muestras de gárgaras con solución salina.

En la segunda fase de la validación, se analizaron prospectivamente muestras de gárgaras con solución salina no anónimas mediante el ensayo de PCR de extracción estándar y el flujo de trabajo HGDirect-PCR. La interpretación y el análisis de discrepancias se realizaron antes de informar, como se describe a continuación.

Se realizó un proceso de auditoría de tiempo para determinar el tiempo práctico total necesario para configurar (a.) la purificación de ARN KingFisher estándar con pipeteo manual y (b.) HGDirect-PCR para 92 muestras y 4 controles. Cada paso del proceso, incluido el inicio de sesión, la impresión de códigos de barras, la distribución de alícuotas de muestras y la preparación de reactivos para la extracción y la PCR, se cronometró individualmente (Fig. 4). El proceso de auditoría de tiempo se realizó durante tres días separados, por tres tecnólogos de laboratorio médico diferentes de forma independiente. El tiempo necesario para cada paso se promedió y se redondeó al minuto más cercano.

En nuestro laboratorio se implementó un algoritmo de interpretación conservador para muestras clínicas para brindar mayor seguridad contra contaminantes y falsos positivos (Fig. 3). Una muestra se consideró positiva (“POS”) si ambos genes del SARS-CoV-2 (S y ORF8) se detectaron con una CT de ≤ 33. Si ambos genes virales no se detectaron, la muestra se consideró negativa (“NEG”). siempre que el gen RNaseP humano fuera positivo (CT ≤ 50). Los resultados positivos de una sola diana de SARS-CoV-2 (S+/ORF8− o S−/ORF8+) se clasificaron como “indeterminados” (“IND”), mientras que aquellos que no registraron ningún resultado para ninguna de las dianas genéticas (S/ORF8 /RNaseP) se clasificaron como “No válido” (“IVLD”). Si no se dispensó ninguna muestra en la reacción del ensayo RT-qPCR debido a un error de dosificación de líquido, no se registraron datos de RT-qPCR y estas muestras se clasificaron como "INVLD". Las muestras IND/IVLD y las muestras débilmente positivas (CT 33–40) se resolvieron clínicamente analizando la muestra original del paciente en el Xpert Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid, Sunnyvale, CA, EE. UU.) o el BDMAX SARS-CoV- 2 ensayo (Becton Dickinson, Ciudad de Quebec, QC, Canadá). Para los informes clínicos, se aceptó el resultado de las pruebas comerciales. El ensayo Xpert Xpress SARS-CoV-2 ha sido aprobado por Health Canada para el tipo de muestra de gárgaras con solución salina (https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/ dispositivos-médicos/autorizados/uso-expandido.html).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Descargar referencias

Este estudio fue financiado por los Servicios de Medicina de Laboratorio Provincial de Columbia Británica y por una generosa subvención del Instituto Peter Wall de Estudios Avanzados (PWIS) de la Universidad de Columbia Británica. Agradecemos al Biobanco del BC Children's Hospital por el préstamo del instrumento Hamilton STARlet para la pandemia de COVID-19. También nos gustaría agradecer la ayuda de nuestros tecnólogos calificados, en particular Alice Liu, Maria Ramos, Abbas Dilawer y Virginia Young.

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, División de Microbiología, Virología y Control de Infecciones, BC Children's and Women's Hospital + Sunny Health Center, Vancouver, Canadá

Vijay J. Gadkar, David M. Goldfarb, Ghada N. Al-Rawahi, Jocelyn A. Srigley, Nicole Watson, Tammy Chen, Sunny Lam y Peter AG Tilley

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Facultad de Medicina, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Canadá

Vijay J. Gadkar, David M. Goldfarb, Ghada N. Al-Rawahi, Jocelyn A. Srigley, Linda Hoang y Peter AG Tilley

Centro de Ciencias del Genoma Michael Smith de Canadá en BC Cancer, BC Cancer Research Institute, Vancouver, BC, Canadá

Duane E. Smailus, Robin JN Coope y Stephen Pleasance

Laboratorio de Salud Pública, Centro para el Control de Enfermedades de Columbia Británica, Vancouver, Canadá

Linda Hoang

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, División de Microbiología, Virología y Control de Infecciones, BC Children's and Women's Hospital, Room No 2K9, 4500 Oak St, Vancouver, V6H 3N1, Canadá

Vijay J. Gadkar

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Correspondencia a Vijay J. Gadkar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gadkar, VJ, Goldfarb, DM, Al-Rawahi, GN et al. Detección clínica sin extracción del virus SARS-CoV-2 a partir de muestras de gárgaras con solución salina utilizando el manipulador de líquidos Hamilton STARlet. Informe científico 13, 4241 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30993-2

Descargar cita

Recibido: 12 de mayo de 2022

Aceptado: 06 de marzo de 2023

Publicado: 14 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30993-2

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